蔬菜中苯甲酰脲类药物残留的测定方法研究

　　摘  要  建立了一步有机溶剂提取、HPLC分离、紫外检测器检测7种苯甲酰脲类药物（除虫脲、灭幼脲、杀铃脲、氟铃脲、氟苯脲、氟虫脲和氟啶脲）在蔬菜中残留量的方法。考察了不同提取溶剂（乙酸乙酯和乙腈）的提取效率；研究了不同C18固相萃取小柱、活性碳、自制弗罗里硅土柱和GPC对蔬菜样品的净化效果；实验了不同的梯度淋洗程序分离7种药物。通过对黄瓜、大白菜、西红柿和包心菜4种蔬菜的4种添加水平和4次重复性实验，建立了一种以乙腈为提取溶剂和以弗罗里硅土柱为净化柱的高效液相色谱法测定7种苯甲酰脲类药物。该方法线性范围为：0.02～1.5mg/L，7种苯甲酰脲类药物的相关系数均大于0.999，其检出限为0.02～0.05 mg/kg（S/N=10）；在0.05～1.0 mg/kg之间的添加回收率为80 %～120%；相对标准偏差小于15％。方法完全符合残留分析的要求。

　　关键词  苯甲酰脲，残留分析，高效液相色谱

　　Multiresidue Determination of Benzoylurea Insecticides

　　in Vegetable Matrices

　　He Hongmei, Wu Liqin, Zhang Hu, Zhu Jiahong, Xie Lei

　　(Institute of Quality and Standard on Agricultural Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021)

　　Abstract  Onestep extraction and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet detection have been developed and validated for the determination of seven kinds of  benzoylurea insecticides (diflubenzuron, chlorbenzuron, triflumuron, hexaflumuron, teflubenzuron, flufenoxuron and chlorfluazuron) residues in vegetable matrices including Chinese cabbage, tomato, cabbage and cucumber. The extraction efficiency of ethyl acetate and acetonitrile，different cleanup methods including C18 solid phase extraction (SPE) cartridge, hydrophiliclipophilic balance (HLB) SPE cartridge, activated carbon, florisil and GPC and separation by HPLC are extensively investigated. The extraction recoveries of the seven kinds of benzoylurea insecticides are between 80% and 120% for spiked level of 0.05－1.0 mg/kg. The limits of quantification are ranged from 002 to 0.05mg/kg for the seven pesticides (S/N=10). There are good linear correlations between the peak areas and concentrations of the seven kinds of benzoylurea insecticides, the line ar range is 0.02－1.5 mg/L and the correlation coefficients are above 0.999.

　　Keywords  Benzoylurea insecticides,  residue analysis, high performance liquid chromatography

　　本文系浙江省重大科技攻关基金资助项目（No.2005C12007）和浙江省地方标准资助项目（２００４年第二批修订计划Ｎo.5）

　　1  引 言

　　苯甲酰脲类化合物具有抗蜕皮激素的生物活性，能抑制昆虫表皮几丁质合成酶和尿核苷辅酶的活化率，使卵内幼虫缺乏几丁质而不能孵化或孵化后随即死亡 [1]。它们是几丁质抑制中发展最早、成熟品种最多的一类药剂，已商品化生产实际应用的主要种类有：除虫脲、灭幼脲、杀铃脲、氟铃脲、氟苯脲、氟虫脲和氟啶脲。该类药物在粮食、蔬菜和水果上得到广泛的应用，但该类药物的残留对人类存在潜在的危险。美国和欧盟等国家对该类药物都制定了相应的最大残留限量，我国的国家标准中规定灭幼脲在蔬菜中的最大残留限量（MRL）为3.0mg/kg[2]，除虫脲在梨果和柑橘中最大残留限量为1.0 mg/kg[3]，氟苯脲在柑橘中最大残留限量为0.5 mg/kg[4]。国内有关于除虫脲、灭幼脲和杀铃脲的残留检测方法报道[5]，但国内外未见有关同时测定蔬菜中该7种苯甲酰脲类药物残留的方法[6～11]。本实验对蔬菜中7种苯甲酰脲类药物残留的提取、净化和高效液相色谱分析条件进行了研究。通过对黄瓜、大白菜、西红柿和包心菜４种蔬菜的４种添加水平和４次重复性实验，建立了一种以乙腈为提取溶剂和以弗罗里硅土柱为净化柱的高效液相色谱法测定7种苯甲酰脲类药物，并对实际蔬菜样品进行了该类药物的残留检测。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

　　液相色谱系统：Surveyor PAD Detector, Autosampler and LC pump（美国Thermo Finnigan公司）; 自动浓缩仪(BUCHI Heating Bath B 490, Rotavapor R205 and Vacuum Contoller V800)（Büchi R205型，瑞士步琪有限公司）；SHBⅢ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；高速匀浆分散器(ULTRA TURRAX IKA T18basic，美国VWR公司)；Vario GPC(Gel Permeation Chromatography)全自动净化系统（德国LCTech公司）。

　　除虫脲、灭幼脲、杀铃脲标样溶液购自农业部环境保护科研监测所；氟铃脲、氟苯脲、氟虫脲和氟啶脲均从Sigma 公司购置的对照品。实验用水为二次蒸馏水;乙腈(色谱纯) ;石油醚、丙酮和氯化钠(分析纯) ; SupelcleanTM C18 SPE cartridge（3 mL，500 mg，美国Supelco公司）、Oasis(HLB SPE cartridge (6 mL, 500 mg，美国Waters公司 )、弗罗里硅土（0.３０~0.154 mm粒径，SigmaAldrich 公司，使用前在650℃高温烘4h, 在干燥器内冷却后用5%水脱活备用）；石墨化炭黑（Supelclean ENVICARB，0.128~0.040粒径，美国Supelco公司）。

　　2.2  色谱条件

　　色谱柱为SunFireTM C18, 5 μm颗粒, 250 mm×4.6mm i.d.（美国Waters公司）；线性梯度洗脱方式,流动相A为水,流动相B为乙腈,洗脱程序为0～13min B从60％线性增加至100％，13~16 min保持B为100％，16~18 min B线性减少至60％，18~25 min保持B为60％。流速0.8 mL/min；柱温为室温；进样体积20 μL; 检测波长为260 nm。

　　2.3  实验方法

　　2.3.1  校准曲线绘制

　　准确称取对照品于容量瓶中, 用乙腈定容作为标准贮备液。吸取各标准贮备液, 用乙腈稀释至质量浓度为0～1.5 mg/L的标准系列, 各取20μL 进样分析, 据峰面积与相应质量浓度进行线性回归, 绘制校准曲线。

　　2.3.2  样品处理

　　（１）层析弗罗里硅土柱的制备  净化柱：200 mm×15 mm(直径)玻璃柱，底部垫约0.5 cm高脱脂棉，依次填装1 cm无水硫酸钠、5 g 5%水脱活后弗罗里硅土和1 cm无水硫酸钠, 用石油醚+丙酮（90+10，Ｖ/Ｖ）20 mL前处理后备用；（２）提取和纯化  称取蔬菜样品25 g（精确到0.1 g），加入乙腈50 mL于匀浆杯中，匀浆后过滤，滤液转入装有ＮaＣl的具塞量筒，静置分层后移取20 mL提取液到250 mL平底烧瓶里，旋转蒸发浓缩至近干，然后N2吹干，再用3×5 mL石油醚+丙酮（90+10，V/V）转移上自制的弗罗里硅土柱，上样完毕再用50mL石油醚+丙酮（85+15，V/V）洗脱药物并收集于250mL平底烧瓶，然后浓缩近干并N2吹干，最后用60％的乙腈水溶液溶解残渣并定容至5.00 mL，过膜后进行液相色谱分析。    分 析 化 学第34卷第10期何红梅等:蔬菜中苯甲酰脲类药物残留的测定方法研究

　　3  结果与讨论

　　3.1  提取溶剂的选择

　　乙腈和乙酸乙酯是残留分析中常用的两种提取溶剂[12]。乙腈对物质的提取效率比较好；而乙酸乙酯对极性物质的提取效率较差，通常需要在提取过程中加入大量的无水硫酸钠以提高极性物质的提取效率，而且乙酸乙酯提取体系中会共提取许多大分子的脂质和蜡质的物质，从而需要进一步经过费时和费溶剂GPC净化处理。文献报道多采用乙酸乙酯提取苯甲酰脲类药物[6～11]，本实验选用了乙腈为提取溶剂，并对乙腈和乙酸乙酯两种不同溶剂对7种苯甲酰脲类药物的提取效率进行了对比实验，结果见表1。从表1可见，乙腈能有效的提取出基质中的苯甲酰脲类药物，回收率均在95%以上。表1  不同溶剂提取效率(略)

　　3.2  净化方法的选择

　　样品前处理通常采用的净化方法有液液萃取、固相萃取和GPC方法。本实验考察了SupelcleanTM C18、石墨化炭黑+SupelcleanTM C18、Oasis HLB、弗罗里硅土和GPC ５种净化方法对黄瓜基质的净化效果，结果见图1和图2。实验中发现石墨化炭黑能吸附一些色素，比较图1中两幅色谱图也可以看出过石墨化炭黑+ SupelcleanTM C18的基质中的杂质明显少于只过SupelcleanTM C18的基质，但实验也发现石墨化炭黑完全吸附7种标样，故在实验中没有采用。从图2显而易见：（1）传统的弗罗里硅土玻璃层析柱的净化效果最好，正相机理模式的弗罗里硅土柱基本能净化黄瓜基质中的干扰杂质;（2）反相吸附机理模式纯亲脂性的SupelcleanTM C18的净化效果不如亲水亲脂性的Oasis HLB；（3）GPC虽然能去除大分子的物质，但是许多小分子干扰物质仍然被保留在收集液中，因此其净化效果也不如传统的弗罗里硅土玻璃层析柱。与传统的弗罗里硅土玻璃层析柱相比，C18小柱和HLB小柱均属于反相机理模式，能吸附一些在C18上非极性强保留的物质，也能去除一些强极性物质，但固相萃取小柱的C18含量通常在1 g以下，承载上样量通常比较少。所以实验选择了传统的弗罗里硅土玻璃层析柱作为净化手段。

　　3.3  淋洗曲线的绘制

　　当溶解在90+10（石油醚+丙酮）中的标样在重力作用下通过弗罗里硅土玻璃层析柱后，用90+10（石油醚+丙酮）、85+15（石油醚+丙酮）和80+20（石油醚+丙酮）3种淋洗体系下各100 mL进行淋洗，分5管收集，浓缩后用60％的乙腈水溶液溶解并定容至5.00 mL，进样分析后绘制3种淋洗体系下的淋洗曲线，结果见图3。从图3可见:（1）在90+10（石油醚+丙酮）的淋洗条件下前20 mL淋洗液未洗脱出药物，直到100 mL才把药物的80％~90％洗脱下来；（2）在85+15（石油醚+丙酮）的淋洗条件下，前20 mL能洗脱50%左右的灭幼脲、杀铃脲和氟铃脲，50 mL洗脱液基本能把7种药物洗脱下来，随后增加的淋洗液对药物回收率增加不大;（3）在80+20（石油醚+丙酮）的淋洗条件下，前20 mL能洗脱50%以上的除了氟铃脲之外的6种药物;40 mL洗脱液基本能把7种药物洗脱下来，随后增加的淋洗液对药物回收率增加不大。80+20（石油醚+丙酮）的淋洗液的极性太强，容易洗脱出更多的干扰杂质，所以实验选择了90+10（石油醚+丙酮）作为上样液，85+15（石油醚+丙酮）作为淋洗液。

　　3.4  梯度淋洗程序

　　在流速为1.0 mL/min和流动相为80+20（乙腈+水）等度条件下，10 min能洗脱出7种药物，但灭幼脲、杀铃脲和氟铃脲3个峰重叠在一起；在70+30（乙腈+水）等度的体系下，7种脲的分离度均超过1.5，获得完全的分离。但是出峰时间较迟的氟虫脲（20.66 min）和氟啶脲（25.66 min）的灵敏度较低。所以实验选择了梯度洗脱程序，这样既提高灵敏度，也能缩短分析时间。7种脲类标样分离色谱图见图4，出峰顺序为：除虫脲、灭幼脲、杀铃脲、氟铃脲、氟苯脲、氟虫脲和氟啶脲。

　　3.5  线性方程和检出限

　　考察了7种脲类药物的浓度在0.02～1.5 mg/L之间的线性关系，其结果列于表2。从表2可以看出，7种药物在0.02～1.5 mg/L范围内，药物浓度和响应的峰面积成良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999。以10倍信噪比确定7种药物的定量检出限分别为： 0.03、0.02、0.03、0.04、0.05、0.04和0.03 mg/kg。表2  线性方程和线性范围（略）

　　3.6  方法的准确度和精密度

　　通过黄瓜、大白菜、西红柿和包心菜的４档添加标准溶液（0.05、0.2、0.5和1.0mg/kg）回收率实验，考察了方法的准确度，并且通过每档浓度的四次重复实验考察方法的精确度（详见附表www.analchem.cn/table/N051327.pdf）。7种药物回收率均在80％～120％之间；相对标准偏差（RSD％）均小于15％，说明该方法完全符合残留分析的要求。应用该方法对某城市批发市场的4个不同品种的蔬菜样品进行了脲类药物残留的检测，每个品种选取了四个不同基质，并用二极管阵列检测器收集紫外图谱进行定性分析，结果列于从表3可见，除了杀铃脲未在实际蔬菜样品中检出外，其余6种农药均有痕量检出，但都未超过最大残留限量。说明目前该类农药在使用过程中控制得比较好，没有出现残留超标的问题。表3。表3  蔬菜样品中7种苯甲酰脲类药物残留检测结果 (略)注(note)：*表示小于定量检出限( less than limits of quantification)。

　　References

　　1  He Kang (何  康). China Pesticide Encyclopaedia(中国农药百科全书). Pesticide Vol.(农药卷). Beijing (北京)：Agriculture Press (农业出版社), 1993： 10

　　2  GB151951994 the Maximum Residue Limit Criterion of Chlorbenzuron in the Food (食品中灭幼脲最大残留限量标准)

　　3  GB163331996 the Maximum Residue Limit Criterion of amitraz and etc. in the Food. (双甲脒等农药在食品中最大残留限量标准)

　　4  NY8312004 the Maximum Residue Limits of Benzoximate, Buprofenzin, Cypermethin, Fenothiocarb, Fenpropathrin, Fenpyroximate and Teflubenzuron. in the Orange. (柑桔中苯螨特、噻嗪酮、氯氰菊酯、苯硫威、甲氰菊酯、唑螨酯、氟苯脲最大残留限量)

　　5  Huang Yongchun (黄永春), Wang Jijun (王继军)，Fu Xueqi (傅学起)，Huang Shizhong (黄士忠). Journal of AgroEnviroment Science(农业环境科学学报), 2004, 23(3): 615~618

　　6  Tomsej T, Hajslova J. J. Chromatogr. A, 1995, 704: 513~517

　　7  Balinova A. J. Chromatogr. A, 1998, 823: 11~16

　　8  Valenzuela A, Lorenzini R, Redondo M， Font G. J. Chromatogr. A, 1999, 839: 101~107

　　9  Miliadis G E, Tsiropoulos N C, ApladaSarlis P G. J. Chromat. A， 1999, 835: 113~120

　　10  MartinezGalera M, Lopez Lopez T, GilGarcia M, MartinezVidal J, Parrilla Vazquez P. J. Chromatogr. A, 2001, 918: 79~85

　　11  GilGarcia M, MartinezGalera M, LopezLopez T, MartinezVidal J, Mahedero M, Salinas F. Talanta, 2001, 53: 915~925

　　12  Anastassiades M, Lehotay S J. J. AOAC International, 2003, 86(2): 412~431

　　（浙江省农科院农产品质量标准研究所，杭州 310021）