超高效液相色谱—串联质谱法测定鳗鱼中呋线威和溴氰菊酯残留

　　【摘要】  建立了同时快速测定鳗鱼中呋线威和溴氰菊酯残留的超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）分析方法。样品以乙腈为提取剂，经脱脂、浓缩和净化，用流动相溶解，经超高效液相色谱分离，以串联质谱在多反应监测（MRM）模式下测定，在3.2 min内完成呋线威和溴氰菊酯的定量分析。结果表明：呋线威和溴氰菊酯的标准曲线在0～10 μg/kg浓度范围内线性良好，相关系数（r）分别为0.9998和0.9995；在1、5和10 μg/kg 添加水平条件下，呋线威和溴氰菊酯的加标回收率分别为83.4%～91.7%和85.6%～95.7%，相对标准偏差（RSD）均小于8％（n=6）；本方法对呋线威和溴氰菊酯的定量限分别为0.07 μg/kg和0.45 μg/kg（S/N≥10）。

　　【关键词】  超高效液相色谱串联质谱法，鳗鱼，呋线威，溴氰菊酯，残留

　　1  引言

　　呋线威（furathiocarb）又称呋喃硫威，具有触杀、胃毒及内吸作用。它和克百威有相似的杀虫谱和使用剂量，是克百威低毒化杀虫剂品种，其毒性相当于克百威的1/12。溴氰菊酯（deltamethrin）又名凯素灵、敌杀死、右旋顺溴腈苯醚菊酯，是一种拟除虫菊酯类农药，以触杀、胃毒为主，对害虫有一定驱避与拒食作用，无内吸熏蒸作用。由于这两种农药杀虫谱广，对鳞翅目幼虫及蚜虫杀伤力大，广泛用于玉米、油菜、果树等多种农作物，使很多邻近的鳗鱼养殖塘水源受到污染。2007年日本发布实施的进口食品监控计划中，溴氰菊酯和呋喃硫威是新增加的检验项目。我国鳗鱼以出口日本为主，该类药的残留给我国鳗鱼养殖业又提出了一大难题。因此，研究并建立快速、准确、可靠的鳗鱼中呋线威和溴氰菊酯残留的检测方法非常紧迫。

　　目前，国内外报道的有关呋线威的检测方法主要有液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）[1] 和液相色谱法（HPLC）[2]；溴氰菊酯的分析测定方法主要有气相色谱法（GC）[5]、气相色谱质谱法（GCMS）[6]及气相色谱串联质谱法（GCMS/MS）[7]等。而同时检测上述两种农药残留的方法还未见报道。本研究采用超高效液相串联质谱（UPLCMS/MS）技术，建立了同时测定鳗鱼中呋线威、溴氰菊酯的残留量的分析方法。本方法具有灵敏度高、检出限低、分析时间短的优点。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

　　UPLC超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC Core System）、Quattro Premier XE三重四极杆质谱仪、MASSLYNX 4.1质谱工作站软件等（Waters公司）；固相萃取装置（SUPELCO）、高速离心机（上海安亭公司）；氮吹装置（OASYS）、旋转蒸发仪（上海亚荣公司）；超声波清洗器（天津奥特塞恩斯公司）；IKA均质器、涡流混合器等。

　　呋线威、溴氰菊酯（德国Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈、丙酮、甲酸、醋酸铵均为色谱纯（Merck公司）；冰醋酸、二甘醇、异丙醇、无水乙酸钠、对甲苯磺酸、盐酸羟胺均为分析纯（上海生工）；去离子水（Millipore超纯水器自制）。

　　2.2  标准品的配制

　　分别准确称取呋线威、溴氰菊酯标准品各0.0100 g，用丙酮溶解，定容于100 mL容量瓶中，配成浓度均为100 mg/L的呋线威、溴氰菊酯标准储备液，用聚四氟乙烯（PTFE）密封带密封，－16℃避光保存，待用；用丙酮稀释上述储备液，制得相应的标准溶液（1 mg/L）。每星期更新低浓渡单标溶液。

　　分别吸取1.00 mL呋线威和溴氰菊酯标样（1 mg/L）于100 mL容量瓶，用乙腈定容，配成浓度为10 mg/L呋线威、溴氰菊酯混合标准工作液，临用现配。

　　2.3  样品的制备

　　2.3.1  样品处理  鱼样经剖杀去骨和内脏，将肌肉剪成小块用匀浆机捣碎，准确称取5.0 g捣碎样品于50 mL离心管中, 加入20 mL乙腈后用均质器以15000 r/min均质30 s。另取一离心管加入20 mL乙腈以15000 r/min洗涤均质刀，此液留作第二次提取用。将第一次的离心管置于离心机内以5000 r/min离心10 min，把上清液移至100 mL旋转蒸发瓶，残渣按上述操作再次提取，合并上清液，蒸发至近干。

　　2.3.2  样品净化  旋转瓶残渣用2 mL乙腈溶解，超声1～2 min，过已活化处理的酸性Al2O3小柱，再用5 mL乙腈分两次洗涤蒸发瓶，把洗涤液依次淋洗小柱，收集后45 ℃氮气吹干，用1 mL流动相溶解残渣，超声1 ～ 2 min，混匀后以15000 r/min的速度离心10 min，吸取中层液过0.2 μm微孔滤膜，滤液供UPLCMS/MS测定。

　　2.4  色谱分析条件

　　Acquity UPLCTM BEH C18柱（50 mm × 2.1 mm ），粒径 1.7 μm（Waters公司），柱温 40℃；样品室温度 10℃；进样体积 5 μL；流动相：缓冲盐溶液（0.1%甲酸10 mmol/L醋酸铵）和乙腈；流速：0.3 mL/min；乙腈梯度洗脱，梯度洗脱参数见表1。整个分析流程用时3.2 min。

　　2.5  质谱分析条件

　　电喷雾离子源，正离子电离（ESI+）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：105 ℃；二级锥孔电压：5 V；锥孔反吹气：100 L/h；去溶剂气温度：400 ℃；去溶剂气流量：800 L/h。低质量分辨LM1 12.5；高质量分辨HM1 12.5；离子能量1：0.8 V；碰撞室入口电压：0.0 V；碰撞室出口电压：1.0 V；反应气体（Ar）流量：0.2 mL/min；碰撞室压力：4.80 × 10－3 Pa；低质量分辨LM2 12.5； 高质量分辨HM2 12.5；离子能量2：1.0 V；光电倍增器电压：650 V。在分析过程中，以保留时间和离子对（母离子和两个子离子）信息比较进行定性分析；以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析。呋线威、溴氰菊酯在多反应检测模式下的质谱参数见表2。

　　表１  梯度洗脱参数（略）

　　Table 1  Parameters for procedure of gradient elution

　　“*”：表示待梯度前一时间结束后直接改变比例(indicated the ratio was changed directly when the former time finished).

　　表2  呋线威、溴氰菊酯的质谱参数（略）

　　Table 2  MS parameters for furathiocarb and deltamethrin

　　带下划线的子离子用来作定量分析 （the product ions underlined were used for quantitative analysis）。

　　3  结果与讨论

　　3.1  提取条件及净化条件的选择

　　该类农药的提取一般都是采用单一有机溶剂或者几种有机溶剂的混合液，而针对不同的样品，提取剂的选择存在较大的差异。目前，常用于该类农药的提取剂有石油醚/乙醚[4]、乙腈[5]、乙酸乙酯[6]、二氯甲烷[7]等。由于鳗鱼样品油脂含量较高，而油脂在乙腈中溶解最少，所以选用乙腈为提取剂既不影响该类农药的提取，又可简化样品净化的过程，缩短检验时间。尽管在质谱分析中脂肪的存在并不会干扰目标物的分析，但是去除脂肪等杂质有助于降低离子抑制效应，提高离子化效率和仪器检测灵敏度，因此本实验中选用Al2O3小柱过滤除去提取液中的脂类物质。

　　3.2  超高效液相条件的优化

　　呋线威与溴氰菊酯的分离在超高效液相色谱中很容易实现。由于流动相的选择对目标物离子化效率具有非常显著的影响。比较了不同流动相（包括纯水、2 mmol/L醋酸铵、0.1%甲酸+5 mmol/L醋酸铵、0.1%甲酸+10 mmol/L醋酸铵）条件下目标物的离子化效率。结果显示，选用0.1%甲酸+10 mmol/L醋酸铵作为流动相，目标物的离子化效率最佳。

　　3.3  质谱条件的优化

　　将标准品配成浓度为500 μg/L的Ｖ（乙腈）∶Ｖ（水）＝１∶1混合溶液，选择ESI+作为电离模式，分别对电离电压、锥孔电压、离子源温度、去脱溶剂气温度、Rflen及碰撞能量等条件进行了优化。通过全扫描方式观察总离子流图，得到母离子峰，通过碰撞反应进行子离子扫描确定各物质的定量和辅助定性离子，再进行MRM测定。反复优化，直至仪器检测达到最佳响应。

　　呋线威与溴氰菊酯的响应值差异很大，呋线威比溴氰菊酯高两个数量级。为了兼顾两者的检出限等指标，重点考虑溴氰菊酯的优化，将很多质谱参数的优化倾向溴氰菊酯，以使两个物质都有比较低的检出限和定量限。溴氰菊酯的m/z 523母离子在12 eV和17 eV能量下碰撞后母离子的残留量较多。然而加大碰撞能量后，子离子强度并没有增强，反而减小，并且找不到强度更高的其它质荷比的峰，所以选择12 eV和17 eV产生强度比较高的m/z 506和281为检测子离子。10～50 eV的碰撞能量下m/z 523母离子的m/z 50～550的子离子碎片扫描见图1。呋线威在12 eV和17 eV能量下仪器响应也很高，在此不作讨论。

　　图1  不同碰撞能量下溴氰菊酯标准品子离子扫描比较（500 μg/L）（略）

　　3.4  呋线威和溴氰菊酯的色谱分离

　　按“2.3”节所述方法对加标样品处理，按上述色谱条件进行测定，标准样品溶液中呋线威和溴氰菊酯的保留时间分别为1.8 min和2.6 min（见图2）。

　　图2  呋线威、溴氰菊酯混合标样色谱图（2.5 μg/kg）（略）

　　Fig.2  Chromatogram of the mixture of furathiocarb and deltamethrin standards(2.5 μg/kg)

　　3.5  标准曲线线性和检出限

　　在空白鳗鱼样品分别添加适量标准混合液，使样品加标浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/kg，与样品同步处理，并进行UPLCMS/MS测定。采用外标法定量，以质量浓度（μg/kg）为横坐标x、峰面积为纵坐标y进行线性回归。以信噪比为3确定方法的检出限，以信噪比为10确定最低定量限，结果见表3。结果显示，呋线威和溴氰菊酯在0～10 μg/kg浓度范围内线性良好，而本方法的定量限远远低于国际通行最高限量规定，完全可以满足实际工作的检测需要。

　　3.6  回收率与精密度

　　对空白鳗鱼肉样品在1、5和10 μg/kg浓度水平上进行加标回收实验。呋线威、溴氰菊酯的加标回收率在83.4%～95.7%之间，测定的相对标准偏差均小于8%（见表4）。

　　在本方法的UPLCMS/MS条件下，3.2 min 内就完成鳗鱼中呋线威和溴氰菊酯残留测定。结果准确可靠，重复性好，灵敏度高。呋线威和溴氰菊酯的定量限分别为0.07和0.45 μg/kg，能满足日本最新的法规限量要求。

　　表3  标准曲线的线性方程和相关系数（略）

　　表4  样品加标回收率和精密度（n=6）（略）

　　【参考文献】

　　１ Anna S, Luciana B, Mirella B. J. Chromatogr. A, 2004, 1036: 161～169

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