高效液相色谱检测动物肌肉组织中7种喹诺酮类药物的残留

　　【摘要】本研究建立了同时检测动物肌肉组织中环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸、氟甲喹7种喹诺酮类药物的HPLCFLD检测方法。动物组织样品用磷酸盐水溶液提取，HLB固相萃取柱净化，采用甲酸水溶液乙腈体系作为流动相，梯度洗脱，程序波长荧光检测器检测。方法的线性范围为03～100 μg/L，相关系数(r)大于09989；检出限为01~03 μg/kg，定量限为03~1.0 μg/kg；7种喹诺酮类药物在鸡肉和猪肉的平均回收率分别为704％~102.1%和79.6％~105.8%；相对标准偏差分别为1.1％~8.9%和1.3％~9.3%。

　　【关键词】  喹诺酮类药物　肌肉组织　高效液相色谱法　程序波长荧光检测器　多残留检测

　　1  引言

　　喹诺酮类（quinolones，QNs）是一类人工合成的广谱杀菌性抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌活性强、与其它抗菌药物无交叉耐药性等特点而广泛应用于动物和人类的多种感染性疾病的预防和治疗[1]。但过量或不当使用会导致动物性产品中QNs药物残留，除其本身的毒副作用对人体造成直接危害外，更为严重的是人类长期食用含较低浓度QNs药物的动物性食品,容易诱导耐药性的传递，从而影响该类药物的临床疗效[2，3]。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。美国FDA于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用[4]；我国也于2002年规定了环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹等7种QNs药物在动物肌肉组织中的最高残留限量为10~500 μg/kg [5]。喹诺酮类药物在动物组织中的残留分析方法主要有酶联免疫吸附测定法（ELISA）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7~10]和液相色谱质谱分析法（LCMS）[11，12]。董琳琳等[7]用KH2PO4溶液作为提取液，检测了鸡可食性组织中的4种喹诺酮类药物的残留，方法的定量限为4~20 μg/kg。Bailac等[9]用二氯甲烷作为提取液检测了鸡肉中的7种喹诺酮类药物的残留。Verdon等[1２]用5%的三氯乙酸进行提取，建立了多种组织样品中10种QNs残留的HPLCFLD检测方法，但其都在提取过程中使用了氯制剂。本实验旨在建立同时测定动物肌肉组织中7种QNs药物（环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹）多残留的高效液相色谱程序波长荧光检测方法(HPLCＦＬＤ)。组织样品使用水溶液提取，固相萃取柱净化。本方法前处理过程简便、快速、安全，检测结果灵敏、可靠，适用于动物组织中喹诺酮类药物残留的分析检测。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂高效液相色谱仪（美国waters公司）由2695分离系统、2475荧光检测器组成；氮吹仪（NEVAPTM111，美国Organomation Associates公司）；离心机（TDL40B，上海安亭科学仪器厂）；HLB固相萃取柱（60mg，3cc，美国Waters公司）；盐酸环丙沙星（CIP）、单诺沙星（DAN）、恩诺沙星（ENR）、沙拉沙星（SAR）、恶喹酸（OXO）、氟甲喹（FLU）等标准品（中国兽药监察所）；盐酸二氟沙星（DIF）（美国Sigma公司），化学结构如图1所示；乙腈、甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；水为MilliQ超纯水（美国Millipore公司）；其它试剂均为国产分析纯。

　　图1  喹诺酮类药物的化学结构（略）

　　Fig.1  Chemical structures of the quinolones （ＱＮs）

　　2.2  标准溶液的配制分别称取适量环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸、氟甲喹7种标准品，溶解于2 mL 003% NaOH溶液中，用甲醇定容至100 mL，即为01 g/L的标准贮备液；分别量取适量7种标准贮备液，配制7种喹诺酮类药物的混合标准工作液（1.0 mg/L）。准确量取混合标准工作液，N2吹干，用005 mol/L磷酸盐溶液（PB, pH 7.0）稀释，配制成01、03、1．０、10、20、100和200 μg/L的标准溶液，HPLCFLD测定。以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归，得定量标准曲线。

　　2.3  样品前处理称取2.00±002 g空白鸡肉、猪肉组织置于50 mL离心管中，添加适量的标准溶液，旋涡混匀，避光静置15 min后，加入10 mL PB溶液（pH 7.0）进行提取，涡动10 s，3500 r/min离心5 min，上清液倒入另一干净试管中；残留组织用10 mL PB溶液重复提取一次，合并上清液；将HLB固相萃取柱用2 mL甲醇、2 mL水活化，取10 ml提取液上样，3 mL甲醇/水（1∶4，Ｖ/Ｖ）洗涤，最后用2 mＬ甲醇洗脱，N2吹干，PB定容至1.0 mL，过022  μm微孔滤膜，待测。

　　2.4  色谱条件Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， i.d.，Ｗaters公司）；流动相为002%甲酸水溶液（pH 2.8）乙腈体系，梯度洗脱条件如表1所示。进样量：100 μL；柱温：30℃；荧光检测波长：0~16.5 min，λex=280 nm，λem=450 nm；16.5~32.0 min，λex=320 nm，λem=365 nm。

　　表1  HPLC流动相梯度洗脱条件（略）

　　Table 1  HPLC mobile phase gradient program for the analysis of QNs

　　3  结果与讨论

　　3.1  色谱条件的选择与优化环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星等哌嗪喹诺酮类药物（PQs）结构式中含有羧基和哌嗪基，属于酸碱两性化合物，反相液相色谱分析时，色谱峰容易拖尾，通常选择酸性溶液作为流动相的组成部分，有时还加入三乙胺等[6，7]扫尾剂以获得好的峰形。磷酸盐缓冲液[7，8，10，１３，14]、柠檬酸缓冲溶液[9，1５]及离子对试剂[１６，17]常常被用来作为检测喹诺酮类药物的流动相，但其与乙腈、甲醇混合时易产生结晶而引起色谱管路堵塞，且灵敏度较低。由于流动相的pH值对QNs的分离度有很大影响，本实验选用甲酸水溶液作为流动相组成部分，并对不同pH的甲酸水溶液进行了考察。实验结果表明，在相同流动相比例的条件下，随着流动相pH的降低，QNs的保留时间延长；然而当pH过低（<2.0）时，即使调节流动相比例，沙拉沙星和二氟沙星也不能很好的分离，而且低酸度对色谱系统的寿命有影响，故本方法采用pH2.8的甲酸水溶液（002%，Ｖ/Ｖ）乙腈体系作为流动相。另外，环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星等哌嗪喹诺酮（PQs）和恶喹酸、氟甲喹等酸性喹诺酮（AQs）具有不同的荧光光谱，PQs的最佳激发波长（λex）与发射波长（λem）为280 nm和450 nm，而酸性喹诺酮的λex与λem为320 nm和365 nm。

　　图２  7种喹诺酮类药物标准溶液色谱图（略）

　　Fig.2  Chromatogram of quinolones standard solution (100 μg/L for ciprofloxacin (CIP), enrofloxacin(ENR), sarafloxacin(SAR), difloxacin(DIF), oxoflaxacin(OXO), flumequine(FLU), and 30 μg/L for danofloxacin(DAN))

　　本研究建立的HPLCFLD检测方法采用梯度条件进行洗脱，程序波长荧光检测器进行检测，不仅能使7种喹诺酮类药物获得良好的分离，而且能以最佳波长对每个药物进行检测，获得更强的灵敏度。如图2所示，色谱峰尖锐、对称。

　　3.2  标准曲线、线性范围、检出限与定量限在上述最佳色谱条件下检测一系列的QNs混合溶液（0～200 μg/L），以各组分的浓度与其色谱峰面积进行线性回归，呈良好的线性关系，其相关参数见表2。以3倍信噪比（S/N）计算，该方法测定动物肌肉组织中7种QNs药物的检出限为01~03 μg/kg；以10倍信噪比（S/N）计算，该方法的定量限为03~1.0 μg/kg。

　　表2  喹诺酮类药物的回归分析、检出限和定量限（略）

　　Table 2  Regression analysis and limits of detection and quantitation

　　3.3  方法回收率和精密度在空白肌肉添加1~100 μg/kg浓度水平范围内，测得7种喹诺酮类药物在鸡肉和猪肉组织中的平均回收率分别为704％~102.1%和79.6％~105.8%；相对标准偏差为1.1％~8.9%和1.3％~93%（结果如图3和表3所示），表明该方法稳定性强、重现性好，能满足我国对动物组织中喹诺酮类药物残留检测的要求。

　　图3  空白(a)及加标猪肉(b)组织色谱图（略）

　　Fig.3  Chromatograms of blank swine muscle (a) and spiked tissue (b)

　　3.4  样品提取条件的优化生物样品中喹诺酮类药物的提取常用乙醇[1４]、乙腈[10，1４]、三氯乙酸[1７]和二氯甲烷[9，1３]等有机溶剂及其与乙酸、磷酸、氨水等的混合溶液[10，1４]，能够获得较好的回收率；然而近年来，有机溶剂尤其是氯制剂的使用对环境造成的影响越来越受到人们的重视[1８]。

　　表3  添加回收率及精密度测定（n=6）（略）

　　Table 3  Recoveries and RSD of QNs in fortified animal muscle tissues（n=6）

　　本研究借鉴文献[7，８]的样品提取方法，利用磷酸盐缓冲液（PB）对动物组织中7种喹诺酮类药物进行提取，并进行了优化。本研究比较了不同pH的PB溶液（pH=2，7，11）的提取效果，还对涡动时间、离心时间、提取次数进行了考察，结果发现，选用不同pH的PB溶液进行提取，QNs的回收率均可满足检测要求；用酸性或碱性溶液提取的样品杂质干扰较多，而pH 7的PB提取的组织样品，杂质更少，灵敏度更高；样品提取的涡动和离心时间分别大于10 s和5 min时，药物的回收率无明显变化。用PB溶液（pH 7.0）提取一次的回收率为55％~65%左右，提取两次的回收率为70％~110%，提取3次后，回收率没有明显增加。所以本方法采用在不借助高速离心的条件下（3500 r/min），用较短时间（涡动10 s、离心5 min）、以PB缓冲液提取两次、SPE净化的前处理方法。应用本方法在3 h内可完成32个组织样品的前处理（包括提取、净化）。在整个提取、净化过程中仅使用了不到5 mL甲醇；猪肉、鸡肉中的平均回收率为704％~105.8%；相对标准偏差＜93%，定量限为1.0 μg/kg，远低于我国规定的最高残留限量。本研究建立的HPLCFLD检测方法，可同时检测动物肌肉组织中环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸、氟甲喹等7种喹诺酮类药物，方法使用有机溶剂少、污染少、分析时间短、操作简便、精密度高、检出限（定量限）低，能够满足我国现行兽药残留检测分析的要求，适用于动物性食品中喹诺酮类药物的残留检测分析。

　　3.5  实际样品分析对取自北京市场中的10份猪肉和12份鸡肉样品进行了检测，其中在2份猪肉（ZR06001、ZR06008）和3份鸡肉样品中（JR06005、JR06006、JR06012）检测到喹诺酮类药物的残留，检测结果见表4。

　　表4  实际检测样品中喹诺酮类药物的残留（略）

　　Table 4  Quinolone residues in market muscle samples in Beijing

　　ND：未检出（not detected）。

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