固相萃取在线凝胶渗透色谱气相色谱/质谱法测定板栗中44种有机磷农药残留

　　【摘要】建立了板栗中44种有机磷农药多残留的分析方法。样品以Ｖ(乙腈）∶Ｖ(（水）=4∶1为提取剂，经高速匀浆方法提取，提取液以ENＶI18固相萃取柱净化，除去样品中大部分的脂肪和甾醇等干扰基质，再经在线凝胶渗透色谱气相色谱/质谱(GPCGC/MS)分析，进一步除去样液中色素和脂肪等大分子干扰物质，有效地降低了样品中的复杂基质所带来的背景干扰。加标水平为0.05 mg/kg时,大部分农药的回收率为65%～120%, 相对标准偏差小于15%；44种农药的检出限为0.002～0.05 mg/kg。采用外标法定量，气相色谱质谱法(GCMS)定性定量分析，线性关系和回收率结果均满意。实验证明，本方法是一种快速、准确、灵敏度高的同时检测板栗中有机磷农药多残留的检测方法。

　　【关键词】  固相萃取 在线凝胶渗透色谱 气相色谱/质谱 农药多残留 板栗 有机磷农药

　　1  引言
   
　　有机磷农药是用于防治植物病虫害的有机化合物［１］。这类农药品种多，药效高，用途广，易分解，在农药品种中是极为重要的一类化合物。但有不少品种对人、畜的急性毒性很强，由于其具有一定的残留活性，对人类造成潜在的健康威胁和生态环境的污染。
   
　　目前，美国、欧盟和日本等许多发达国家对板栗等坚果中有机磷农药残留提出严格的限量要求，各国坚果中部分有机磷农药最高残留限量见附表1（www.analchem.cn/table/80824.pdf），而我国目前分析坚果中有机磷农药残留的方法不多，已有的方法能检测的有机磷农药品种不能满足残留限量的要求，存在农药品种覆盖面不全、检出限过高等问题，也影响了坚果出口。为此，开展了研究坚果类食品中有机磷农药多残留检测技术及确证技术，丰富和完善现有的农药残留检测方法[２～５]。本实验建立固相萃取在线凝胶渗透色谱气相色谱/质谱法测定板栗中44种有机磷农药残留的分析方法。实验证明，本方法是一种快速、准确、灵敏度高的同时检测板栗中有机磷农药多残留的检测方法。解决现有坚果中农药残留快速检测方法针对性不强、覆盖率低等突出问题。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂
   
　　GPCGC/MS QP 2010Plus在线凝胶渗透色谱气相色谱质谱联用仪（日本岛津公司），配有PTＶ(进样口和EI源；高速匀浆机；氮吹仪（美国）；旋转蒸发器(德国IKA公司)；高速离心机(湘仪有限公司)。
   
　　丙酮、环己烷和乙腈均为农残级试剂；无水Na2SO4（分析纯）, 650 ℃灼烧4 h,贮于密封干燥器中备用；NaCl（分析纯）, 200 ℃烘干2 h。
   
　　甲胺磷、敌敌畏、速灭磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、丙线磷、治螟磷、甲拌磷、甲基乙拌磷、乐果、特丁磷、二嗪磷、乙拌磷、乙嘧硫磷、磷胺、甲基毒死蜱、甲基对硫磷、甲基立枯磷、皮蝇磷、杀螟硫磷、甲基嘧啶磷、马拉硫磷、倍硫磷、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、丙胺磷、毒虫畏、喹硫磷、稻丰散、灭蚜磷、杀扑磷、乙基溴硫磷、丙硫磷、恶唑磷、乙硫磷、三唑磷、敌瘟磷、亚胺硫磷、苯硫磷、保棉磷、伏杀硫磷、吡嘧磷以及蝇毒磷等农药标准品（北京陆桥责任有限公司）。
   
　　ENＶI Carb固相萃取柱(1000 mg,6 mL,Supelco公司)；ENＶI18固相萃取柱：(2000 mg ,12 mL,Supelco公司)； PSA固相萃取柱(500 mg, 3 mL, 瓦里安公司）。

　　2.2  色谱质谱条件
   
　　GPC条件：Shodex CLNpak EＶ200凝胶色谱柱（150 mm×2.1 mm）；流动相为Ｖ(丙酮)∶Ｖ(环己烷)=3∶7；流速：0.1 mL/min; 柱温：40 ℃；进样量： 20 μL。
   
　　GCMS条件：惰性熔融硅毛细管柱色谱（5 m×0.53 mm）；DB5MS预柱（5 m×0.25 mm， 0.25 μm）；DB5MS分析柱（25 m×0.25 mm， 0.25 μm）。
   
　　PTＶ 进样模式：进样口起始温度120 ℃，保持5 min，以100 ℃/min程序升温至250 ℃，保持41.7 min。
   
　　色谱柱升温程序：色谱柱起始温度82 ℃，保持5 min，以8 ℃/min程序升温至280 ℃，保持5 min；载气：He气；电子轰击源（EI）；离子源温度：200 ℃；接口温度：280 ℃；扫描时间：12.0～38.0 min；扫描方式：选择离子监测模式。

　　2.3  标准溶液的配制
   
　　分别准确称取适量的每种农药标准品（纯度≥98.0%），用丙酮分别配制成100.0 mg/L的标准储备液；混合标准溶液：根据需要再用丙酮逐级稀释成浓度分别为0.005 0.01 0.05 0.2和0.5mg/L的系列混合标准工作溶液。
   
　　2.4  样品前处理
   
　　称取5 g粉碎的板栗样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL水，20 mL乙腈，用匀浆机高速均质2 min后，加入4 g NaCl，用盖子密封后剧烈振荡1 min，然后以3500 r/min离心5 min；准确移取10 mL上清液于15 mL刻度离心管中待用。
   
　　将ENＶI18 ENＶI Carb和PSA固相萃取小柱上分别加2 g无水Na2SO4,先用5 mL乙腈进行预淋洗，然后将样品提取液上样，再用10 mL乙腈进行洗脱，收集洗脱液15 mL于50 mL刻度离心管中，用氮气吹至近干，以Ｖ(丙酮)∶Ｖ(环已烷)=3∶7混合液定容至2.5 mL，进行GPCGC/MS测定。

　　3  结果与讨论

　　3.1  色谱条件的选择
   
　　经进样和检测温度、程序升温以及选择离子分组等实验，建立的色谱质谱条件可以分离44个有机磷农药组分，峰形良好。图1为混合标准的GPCGC/MS色谱质谱图。

　　3.2  提取溶剂的选择
   
　　由于板栗中含有丰富的糖、淀粉、蛋白质、脂肪及多种维生素等物质，为了确定样品中的干扰基质，将板栗样品经均质提取法提取后在全扫描模式下得到谱图2。根据NIST谱库检索分析，图2中保留时间在23.0～25.0 min、 27.0～29.0 min和30.0～32.0 min的主要干扰物质为脂肪酸和植物甾醇类物质，这两大类物质是导致样品基质干扰的主要原因。因此，选用Ｖ(乙腈）∶Ｖ（水）=4∶1为提取剂时，从样品中提出来的脂肪和甾醇类等干扰物质比用丙酮作提取溶剂时少了很多。对于脂质含量高的板栗样品而言，乙腈对脂肪和色素的溶解能力最小，且大多数有机磷农药在乙腈中的溶解度很高，乙腈对于大多数样品基质的渗透能力强，是农药多残留分析常用的提取溶剂。因此,选用Ｖ（乙腈）∶Ｖ（水）=4∶1作为该样品中农药组分的提取剂，既能得到高的提取效率，又能在很大程度上降低脂肪和甾醇类物质对分析的干扰，是坚果类食品复杂基质样品中多农药残留检测技术的首选溶剂。

　　3.3  固相萃取条件的选择
   
　　由于板栗样品基质中的脂肪酸和甾醇类物质产生的强烈基质效应影响了检测农药组分的回收率[6，７]，因此本方法采用固相萃取技术来减弱样品中干扰物所带来的基质效应。本方法通过大量实验，优化了不同类型固相萃取柱的淋洗条件，比较了ENＶＩ Carb ENＶI18和PSA等固相萃取小柱除去样品中脂肪酸和甾醇类物质的能力，以乙腈为洗脱液，洗脱有机磷化合物，保留脂类化合物。通过洗脱曲线（见图3）可以看出，收集15 mL洗脱液可以保证方法的回收率。
   
　　图1  44种有机磷农药标准品的气相色谱质谱图（略）

　　Fig.1  Chromatograms of 44 organophosphorous pesticides standard

　　1. 甲胺磷(methamidophos)； 2. 敌敌畏(dichlorvos); 3. 速灭磷(mevinphos)； 4. 乙酰甲胺磷(acephate)； 5. 氧化乐果(omethoate)； 6. 丙线磷(ethoprophos)； 7. 治螟磷(sulfotep)； 8. 甲拌磷(phorate)； 9. 甲基乙拌磷(thiometon)； 10. 乐果(dimethoate)； 11. 特丁磷(terbufos)； 12. 二嗪磷(diazinon)； 13. 乙拌磷(disulfoton)； 14. 乙嘧硫磷(etrimfos)； 15. 磷胺(phosphamidone)； 16. 甲基毒死蜱(chlorpyrifosmethyl)； 17. 甲基对硫磷(parathionmethyl)； 18. 甲基立枯磷(tolclofosmethyl)； 19. 皮蝇磷(fenchlorphos)； 20. 杀螟硫磷(fenitrothion)、甲基嘧啶磷(pirimiphosmethyl)； 21. 马拉硫磷(malathion)； 22. 倍硫磷(fenthion)； 23. 毒死蜱(chlorpyrifos)； 24. 对硫磷(parathion)； 25. 水胺硫磷(isocarbofos)； 26. 丙胺磷(isofenphos)、毒虫畏(chlorfenvinphos)； 27. 喹硫磷(quinalphos)、稻丰散(phenthoate)、灭蚜磷(mecarbam)； 28. 杀扑磷(methidathion)； 29. 乙基溴硫磷(bromophosethyl)； 30. 丙硫磷(prothiophos)； 31. 恶唑磷(isoxathion)； 32. 乙硫磷(ethion)； 33. 三唑磷(triazophos)； 34. 敌瘟磷(edifenphos)； 35. 亚胺硫磷(phosemet)； 36. 苯硫磷(EPN)； 37. 保棉磷(azinphosmethyl)； 38. 伏杀硫磷(phosalone)； 39. 吡嘧磷(pyrazophos)； 40. 蝇毒磷(coumaphos)。 

　　图2  板栗样品经Ｖ(乙腈）∶Ｖ（水）=4∶1提取后未净化的气相色谱质谱总离子流图（略）

　　Fig.2  TＩC chromatogram of chestnut sample extracted with acetonitrilewater (4∶1, Ｖ／Ｖ) 

　　图3  44种有机磷农药在ENVＩ18固相萃取柱上的洗脱曲线图（略）

　　Fig.3  Elution curves of 44 pesticides in ENＶＩ18 solid phase extraction coulmn

　　实验证明，ENＶI Carb固相萃取柱的相对除脂能力最弱，样液过柱前后没有明显的净化效果； PSA固相萃取小柱的净化效果一般，净化后样液中还有少量的脂肪酸对待测农药有干扰；ENＶI18固相萃取柱相对除脂能力最强，能够有效地降低样品中的基质效应。

　　3.4  标准曲线和检出限
   
　　配制质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mg/L的44种农药的标准混合溶液，进行GPCGC/MS分析。测定时，根据其标准物质和待测样品的SIM离子流图中的峰面积，外标法定量分析。以农药的选择离子的峰面积（A）对农药的质量浓度（C，mg/L）绘制标准曲线，并求得直线回归方程和相关系数，结果见表1(详表见附表2,www.analchem.cn/table/80824.pdf)。
   
　　在定量计算过程中，由于样品基质中的碎片离子与多数被测化合物的基峰有干扰[8]，因此为了准确定量，选取没有干扰或干扰最小的碎片离子为定量离子。在定性确证时，被测物应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致。相对丰度允许偏差对定性离子来说，相对丰度大于50%时，允许的相对偏差为±10%；对定性离子来说的相对丰度范围在20%～50%、10%～20%和小于10%时，允许的相对标准偏差分别为±15%、±20%和±50%。

　　表1  44种有机磷农药的定量、定性选择离子和线性关系及检出限(简表)（略）

　　Table 1  Selected ions for quantitative and qualitative analysis and linear regression equation,detection limit of organophosphorous pesticides（brief）

　　3.5  方法的回收率及精密度
   
　　本方法采用标准加入法[9]，取已粉碎均匀的空白板栗样品，准确加入44种农药的混合标准溶液，分别制备添加浓度为0.05和0.2 mg/L的样品各5份，按上述方法提取净化样品，并进行GPＣGCMS分析，计算平均回收率和精密度，结果得到所有农药的回收率均在65%～120%之间，精密度也均小于15%。

　　4  结论
   
　　本方法采用固相萃取技术预先处理样品和先进的GPＣGC/MS技术相结合的分析方法，与独立的GPC净化方式比较，将液相色谱分离技术与气相色谱/质谱有机结合，有效解决了板栗这类低水分高脂质等坚果类样品前处理复杂、基质干扰严重的难题，建立了一种适合于板栗中农药多残留分析的方便、快捷、准确的分析方法。

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