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【摘要】 目的建立以高效液相色谱（HPLC）法测定双黄连注射剂中组分含量的方法。方法以甲醇-水（10%的磷酸溶液调节pH至2.7）为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为326 nm，在Diamonsil（钻石）C18 (5 μm,4.6 mm×150 mm) 色谱柱上洗脱，外标法定量，黄芩苷含量可测定。 结果黄芩苷在5.1～81.6 μg/ml范围内呈良好的线性关系，r=0.999 8，平均加样回收率为100.34%，RSD= 0.82 %(n=5 )。 结论该方法简便，灵敏，重复性好，结果准确，精密度较高，线性关系良好，回收率也较高，测定结果显示12 h内黄芩苷稳定，适合于双黄连注射剂的质量控制。
【关键词】 双黄连注射剂 黄芩苷 高效液相色谱法
双黄连注射剂是近年来研制的中药制剂，在临床上主要用于急性上呼吸道感染、急性支气管炎、急性扁桃腺炎、肺炎及急性尿路感染等，其疗效确切，安全，应用十分广泛。双黄连注射剂由金银花、黄芩、连翘3味中药提取制成，主要成分为黄芩苷、绿原酸、连翘苷等［1］。药理学研究已证实黄芩苷具有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、抗变态反应、解毒等作用；绿原酸具抗菌消炎、清热解毒等作用；而连翘苷则具有较强的抑菌、抗病毒的活性。
双黄连注射剂黄芩苷含量测定的方法主要有高效液相色谱法、薄层扫描法、 紫外分光光度法等，高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快且精准等特点，适合中药成分的多样性及复杂性，在双黄连制剂的质量控制上应用也最多。本文通过优化色谱条件测定黄芩苷的含量，以期为进一步研究双黄连注射剂中绿原酸及其它成分打下基础，为双黄连注射剂工艺研究和质量控制提供理论基础。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司）；TU－1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责公司）；KQ－100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（上海精科天平）；予华SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省巩义市英峪予华仪器厂）；Diamonsil（钻石）C18色谱柱（5μm，4.6 mm×150 mm Cat.no：9990 Ser.no：8011571 Dikma Technologies）。
1.2 试剂 双黄连注射液（批号Z23021166 黑龙江乌苏里江佳大制药有限公司）；黄芩苷化学标准品（批号110715－200514, 中国药品生物制品检定所）；色谱甲醇（天津大茂化学试剂厂）；分析纯甲醇（天津市北方天医化学试剂厂 ）；磷酸（河北省保定化学试剂厂）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件Diamonsil（钻石）C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）,流动相为A-甲醇（色谱纯） ：B-蒸馏水（50∶50），流速为1.0 ml/min，检测波长为326 nm，进样量20 μl。其分离色谱见图1～2。
2.2 溶液的制备
2.2.1 标准品溶液的配制 精密称取黄芩苷标准品0.005 100 g至50 ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至刻度，超声至其完全溶解。配制成浓度为0.102 mg/ml的储备液放入冰箱，低温储存。
2.2.2 供试品溶液的配制 用0.1 ml的移液管从双黄连注射液中精密吸取0.05 ml至10 ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至刻度，超声10 min使溶解。再用0.45 μm的滤膜过滤至用铬酸洗液浸泡3 h并干燥好的10 ml比色管中，扭紧塞子。
2.3 线性关系考察 精密量取浓度为0.102 mg/ml黄芩苷标准品储备液0.5，1，2，4，6，8 ml分别至10 ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至刻度，配制成浓度为5.1，10.2，20.4，40.8，61.2，81.6 μg/ml的一系列标准溶液后，再用0.45 μm的滤膜过滤至用铬酸洗液浸泡3 h后干燥好的6支10 ml比色管中，扭紧塞子。按上述色谱条件进行测定，每个浓度的黄芩苷标准液测3次。根据3次峰面积的平均值，求黄芩苷的标准曲线。结果见表1，黄芩苷在5.1～81.6 μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。回归方程为Y = 41.409X -132.35 ，r=0.999 8。
2.4 加样回收率测定 用1.0 ml的移液管从双黄连注射液中精密吸取1 ml至100 ml容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容，并超声10 min使其完全溶解。从中吸取5 ml至10 ml容量瓶中，共5份，各精密加入黄芩苷标准品储备液0.051，0.102，0.204，0.306，0.357，0.510 mg，用甲醇（分析纯）定容至刻度，并超声10 min使其完全溶解，按上述色谱条件进行测定，根据峰面积，计算黄芩苷含量，并计算黄芩苷的平均加样回收率。结果见表2。表1 黄芩苷的线性关系考察实验数据表2 黄芩苷的加样回收率实验结果
2.5 精密度实验 取双黄连注射液1支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液1份，按上述色谱条件进行测定，共进样5次。结果见表3。表3 黄芩苷的精密度实验结果
2.6 重现性实验 取同一批号双黄连注射液5支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液5份，按上述色谱条件进行测定。结果见表4。表4 黄芩苷的重现性实验结果
2.7 稳定性实验 根据供试品溶液的配制法配制样品溶液一份，在室温下放置，分别于0，3，6，9，12 h时按上述色谱条件测定一次峰面积，实验结果RSD=1.22％，表明黄芩苷在12 h内稳定，结果见表5。表5 黄芩苷的稳定性实验结果
2.8 样品含量测定 根据供试品溶液的配制法配制样品溶液，按上述色谱条件进行测定。经实验测得双黄连注射液中黄芩苷的含量为7.1 mg/ml。结果见图1～2。
3 讨论
双黄连注射剂的不良反应源自中成药的复杂成分，如金银花中所含有的绿原酸和异绿原酸，不仅具有抗菌抗病毒作用，又具有致敏原作用，可引起变态反应，是引起过敏反应的主要原因之一。童路［2］报道双黄连针剂引起的过敏反应与黄芩苷有关，毒性反应与黄芩中的另一种成分有关。
图1 黄芩苷化学标准品HPLC图
图2 样品 HPLC图
黄芩苷与绿原酸的极性相差极大，在质量标准中也只规定两者含量分别测定，用HPLC法同时测定两者含量，多采用梯度洗脱法逐渐降低流动相极性的方法,而吸收波长一般选择326 nm，以提高绿原酸的灵敏度。黄芩苷的HPLC测定，其流动相有甲醇∶水∶冰醋酸(5∶50∶1)；甲醇∶水∶磷酸(50∶50∶0.2)；异丙醇∶甲醇∶3%的醋酸(5∶30∶65)；甲醇∶0.5%三乙胺(75∶25)系统。而在2005年版《中国药典》中黄芩苷的色谱条件与系统适用性试验为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶水∶冰醋酸（50∶50∶1）为流动相，检测波长为274 nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于1 500。但我们在实验条件摸索过程中发现，流动相采用甲醇∶水（用10%磷酸调节pH至2.7），比例定为50∶50，黄芩苷与注射液中其它组分分离良好，并且能减少磷酸盐对泵的侵蚀等。
双黄连注射剂中主要成分分析方法报道很多［3～5］，但制剂中其它成分分析方法少见报道，本文旨在通过黄芩苷的分析测定，进一步找出其中各种成分的分析、分离方法，探讨双黄连注射剂不良反应的原因。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：405.
［2］ 童 路．双黄连注射液的工艺及在临床的不良反应［J］.上海医药，1997，4：26.
［3］ 张 洁，马百平，赵 阳，等. 双黄连粉针剂指纹图谱中特征色谱峰的组成药味归属及定性［J］.中成药，2005，12（12）：12.
［4］ 郭 忠.双黄连制剂含量分析方法综述［J］.中国药事，2004，18（3）：25.
［5］ 马宏波，邓光瑞.改进HPLC法测定双黄连粉针中黄芩苷和绿原酸含量［J］.中医药学报，1999，27（1）：59.