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【摘要】 【目的】测定并比较川芎不同炮制品中游离阿魏酸、总阿魏酸的含量。【方法】采用超声提取法，以甲醇—甲酸(95∶5,V/V)为游离阿魏酸的提取溶剂，以甲醇—20 g/L NaHCO3(95∶5,V/V)为总阿魏酸的提取溶剂;采用高效液相色谱(HPLC)法测定，色谱条件为：Diamonsil C18分析柱(250 mm×46 mm，5 μm);流动相为乙腈—体积分数1%冰醋酸(20∶80,V/V);检测波长：320 nm;流速:10 mL/min;柱温：室温。【结果】酒炙川芎的游离阿魏酸和总阿魏酸含量均高于生品及制川芎。川芎生品与不同制品水煎液中阿魏酸含量均高于其游离阿魏酸含量。【结论】本研究含量测定方法简便、准确，可用于川芎及其炮制品中阿魏酸含量的测定研究;测定川芎中总阿魏酸的含量更能反映川芎的质量。
【关键词】 川芎/生产与制备;川芎/化学;阿魏酸/分析;色谱法，高压液相
川芎为伞形科多年生草本川芎Ligusticum chuanxiong Hort的根茎[1]，具有行气活血、祛风止痛之功效，临床上有生川芎、酒炙川芎以及制川芎(广东习用)等多个炮制品种。川芎中含有内酯类、生物碱、有机酸类或酚类以及中性油类等多种有效成分[2]，其中阿魏酸具有较强的生理活性，具有抑制血小板聚集、解除血管平滑肌痉挛、抗氧化和提高膜稳定性以及抗炎、镇痛、调节免疫功能等药理作用[3-4]。在川芎的质量控制研究中，以阿魏酸的定量分析较多，采用了不同的提取溶剂及提取方法，所测得阿魏酸的含量从049 mg/g至214 mg/g不等[5-8]。有文献报道[9]，当归中的阿魏酸松柏酯，因提取工艺不同可以在一定条件下水解为阿魏酸，故提出了游离阿魏酸和总阿魏酸的概念，前者为药材中的阿魏酸，而后者为游离阿魏酸及其衍生物水解所得阿魏酸之和，因此仅测定游离阿魏酸不足以反映药材的质量。川芎中亦含有阿魏酸松柏酯，本实验测定并比较了川芎不同炮制品中游离阿魏酸、总阿魏酸的含量，并对川芎不同炮制品水煎液中的阿魏酸含量进行了测定，现报道如下。
1材料与方法
11主要仪器与试剂天美高效液相色谱仪(包括HITACHI LC2130泵、L2200自动进样器、LC2030紫外检测器、T2000P工作站);CQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);试验所用水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他所用试剂均为分析纯。
12药物川芎药材购自广州市大翔药材有限公司，经过广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的根茎;阿魏酸对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号：110773200611。
13药物制备取原药材，除去杂质，洗净，闷润，切薄片，低温烘干，筛去碎屑，制备生川芎饮片[10];取生川芎片，按质量比10∶1加入黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒至棕黄色时，取出晾凉，筛去碎屑，制备酒炙川芎饮片[10];取净川芎，用水浸3 h，捞起，沥干水，按质量比10∶1加入黄酒拌匀，待酒被吸尽后，蒸3 h至透心，取出，放冷，切薄片，低温烘干，筛去碎屑，制备制川芎饮片[11]。
14提取溶剂的确定采用超声提取方法，选取了甲醇，甲醇—水(95∶5,V/V)，甲醇—甲酸(95∶5,V/V)，甲醇20 g/L NaHCO3(95∶5,V/V)等提取溶剂进行比较，采用高效液相色谱(HPLC)法，色谱条件为A：体积分数01%冰醋酸水溶液,B:乙腈;梯度洗脱：体积分数19%B 0～18 min，18%～60%B 18～60 min;检测波长：320 nm;流速:10 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μL，观察HPLC图谱，发现阿魏酸的含量发生规律性的变化，在用甲醇20 g/L NaHCO3为溶剂提取时，阿魏酸峰(A峰)面积增大，而B峰(根据文献[9]推测可能为阿魏酸松柏酯峰)几乎消失;以甲醇—甲酸为溶剂提取时，A峰面积最小，B/ A峰面积比最大(图1)。按照文献[9]方法测定游离阿魏酸以尽量保留B峰，测定总阿魏酸则以B峰消失，A 峰明显增大为标准。故选用甲醇—甲酸作为提取川芎药材游离阿魏酸的溶剂，以甲醇—20 g/L NaHCO3为提取总阿魏酸的溶剂。
1甲醇—20 g/L NaHCO3;2甲醇—水;3甲醇;4甲醇—甲酸
15提取时间的确定以甲醇—甲酸及甲醇—20 g/L NaHCO3为提取溶剂，对20、40、60、100 min等超声时间进行考察， 60 min后阿魏酸峰面积均不再明显变化，故选择60 min作为超声提取时间。
16对照品溶液的制备称取阿魏酸对照品适量，精密称定，先用少量甲醇全部溶解标准品，再以甲酸—水溶液(5∶95,V/V)定容至刻度，制得浓度为2324 μg/mL的对照品储备液，备用。
17供试品溶液的制备
171游离阿魏酸样品制备取约05 g药材粉末(过20目筛)，精密称定质量，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇—甲酸溶液，称定质量，超声60 min，放冷，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，过045 μm微孔滤膜，收取续滤液作为供试品溶液。
172总阿魏酸样品制备取约05 g药材粉末(过20目筛)，精密称定质量，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇—20 g/L NaHCO3溶液，称定质量，超声60 min，放冷，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，过045 μm微孔滤膜，收取续滤液作为供试品溶液。
173水煎液样品制备取约05 g药材粉末(过20目筛)，精密称定质量，精密加入25 mL蒸馏水，称定质量，浸泡30 min，回流1 h，放冷，用蒸馏水补足减失的质量，摇匀，过045 μm微孔滤膜，收取续滤液作为供试品溶液。
18色谱条件美国迪马公司Diamonsil C18分析柱(250 mm×46 mm，5 μm);流动相为乙腈—体积分数1%冰醋酸(20∶80,V/V);检测波长：320 nm;流速：10 mL/min;柱温：室温。进样量：10 μL。色谱图见图2。
2结果
21线性关系考察精密量取阿魏酸对照品储备液适量，置10 mL棕色量瓶中，加甲酸—水溶液(5∶95,V/V)定容至刻度，摇匀，配制成浓度为2324、4648、11620、 23240、46480 μg/mL的对照品溶液，分别取上述溶液各10 μL注入液相色谱仪，按18项下色谱条件测定峰面积。以各对照品进样量(X/μg)对峰面积(Y/mAu)进行线性回归，得到标准方程：Y= 513209209 X+15 23367 (r=0999 9)，线性范围0023 24～046 48 μg。
22精密度试验取同一对照品溶液，按18项下色谱条件连续进样5次，测定阿魏酸峰面积sR为135%，表明仪器精密度良好。
23重复性试验取川芎生品，按17项下供试品溶液的制备方法分别制备5份供试品溶液，按18项下色谱条件测定游离阿魏酸平均含量为0364 mg/g，sR为298%;总阿魏酸平均含量为103 mg/g，sR为238%。本方法重现性良好。
2009年第26卷广州中医药大学学报24稳定性实验取同一供试品，按17项下供试品溶液的制备方法分别制备游离阿魏酸供试品溶液及总阿魏酸供试品溶液，并分别在0、5、10、15、20、24 h进样1次，按18项下色谱条件测定峰面积，阿魏酸峰面积sR分别为115%、168%，表明供试品24 h内稳定。
25回收率试验精密称取6份已知含量的供试品各约025 g，每份添加对照品适量，按17项下供试品溶液的制备方法处理，18项下色谱条件测得游离阿魏酸及总阿魏酸含量，并计算回收率。结果见表1、表2。
26样品含量测定精密吸取供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按18项下色谱条件测定游离阿魏酸和总阿魏酸峰面积，计算含量，结果见表3、表4、表5。表1游离阿魏酸加样回收率试验结果表2总阿魏酸加样回收率试验结果表3川芎生品及不同炮制品中游离阿魏酸含量测定表4川芎生品及不同炮制品中总阿魏酸含量测定表5川芎生品及不同炮制品水煎液中阿魏酸含量测定
3讨论
川芎中含有阿魏酸和阿魏酸松柏酯，其中阿魏酸松柏酯在中性、强酸或碱性条件下可以水解生成阿魏酸，即使水浴加热都可能不同程度地发生，但弱有机酸可以抑制水解过程[9]。本实验结果表明甲醇—甲酸溶液能较好地抑制阿魏酸松柏酯的水解，而在甲醇—20 g/L NaHCO3中则几乎全部水解，结果与文献报道一致[9]。
炮制加工可以引起川芎中阿魏酸含量的变化，其中游离阿魏酸的含量：酒炙川芎>广东制川芎>生川芎;总阿魏酸的含量：酒炙川芎>生川芎>广东制川芎。按照全国炮制规范所制的酒炙川芎游离阿魏酸及总阿魏酸含量均高于生品，可能与酒炙过程可增加阿魏酸的溶出有关。由于广东地区习用的制川芎为蒸制所得，在炮制过程中阿魏酸和阿魏酸松柏酯都可能发生水解等变化，导致阿魏酸含量的下降。但与生川芎与酒炙川芎相比，制川芎有更浓郁的香气，是否还伴随挥发油等其他成分的变化，尚需进一步研究。
川芎生品及不同炮制品水煎液中阿魏酸的含量：酒炙川芎>生川芎>广东制川芎，且均高于以甲醇—甲酸为提取溶剂测得的游离阿魏酸的含量，说明在水煎煮的过程中，已存在阿魏酸松柏酯的水解，故仅测定川芎中游离阿魏酸的含量不足以反映药材的质量。另外，在许多文献中，川芎中阿魏酸的测定结果有较大偏差，很可能为未考虑到有水解反应的发生，对提取溶剂未做进一步研究的结果。
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