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【摘要】 目的 建立单步萃取反相高效液相色谱法测定人全血中环孢素Ａ(CsA )浓度。方法 病人血样经乙醚单步萃取，环孢素D (CsD)为内标，C18色谱柱，乙腈-水(80：20)为流动相，流速1.0 ml/min，柱温70 ℃，检测波长214 nm。结果 CsA全血浓度在50~600 ng/ml 范围内线性关系良好，r=0.9998，最低检测浓度为20 ng/ml，平均回收率100.44%，日内和日间RSD均<5%。结论 本法简便灵敏、准确可靠、经济，可用于临床人体器官移植术后全血中CsA浓度的监测。
【关键词】 环孢素A；反相高效液相色谱法；血药浓度监测
Abstract： Objective To establish a method of reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) for the determination of cyclosporin A (CsA) in the whole blood by single-step extraction in the patients after renal transplantation.Methods CsA was extracted from the whole blood with diethyl ether and separated using a C18 column. Cyclosporin D was used as internal standard. The mobile phase was composed of acetonitrile-water (80:20). The flow rate was 1.0 ml/min, the temperature was maintained at 70 ℃ and the detecting wavelength was 214 nm. Results The assay was shown to produce linear calibration curves over the range from 50 to 600 ng/ml for CsA (r=0.999 8). The lowest plasma limitation was 20 ng/ml. The average recovery was 100.44%, and the relative standard deviation (RSD) within one day and between days did not exceed 5%.Conclusion The method of RP-HPLC is convenient, accurate and economical for the determination of CsA in the whole blood of the patients after renal transplantation.
Key words： cyclosporin A; reversed phase high-performance liquid chromatography; therapeutic drug monitoring
环孢素A(Cyclosporine A，简称CsA)是一种高效免疫抑制剂，临床主要用于器官移植术后防止排斥反应，提高病人的生存率和移植物的存活率［1］。但由于其治疗窗狭窄，药代动力学参数个体差异大，易产生肾毒害等严重不良反应［2~3］。而且CsA血药浓度水平受到性别、年龄、药物相互作用以及饮食等众多因素的影响［4］。因此，监测全血中CsA的浓度并调整其浓度在有效范围已成为临床使用CsA的常规医疗项目［5］。目前高效液相色谱法(HPLC)和荧光偏振免疫法(FPIA)为CsA浓度测定的最常用方法。国内文献报道的HPLC法，样品预处理一般采用多步萃取法［6~8］，其缺点是操作繁琐、测定周期长、实验成本高；单步萃取法简化了操作过程，测定周期缩短。本研究较系统探讨并建立了一种单步萃取反相高效液相色谱法测定全血中CsA浓度的改良方法，该法具有简便灵敏、准确可靠、经济的特点。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 （1）仪器：高效液相色谱仪(日本岛津公司LC-10A CS -LIGHT 软件)；柱温箱（天津恒奥科技发展有限公司）；快速混匀器（上海医科大学仪器厂）；台式离心机（上海手术器械厂）；超声清洗器（天津东康科技有限公司）；微量分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。（2）试剂：CsA、CsD 对照品（CsA含量为99.3%，CsD含量为97.0%；均由华北制药集团提供）；乙腈、甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。
1.2 色谱条件 色谱柱：C18(美国 5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：乙腈-水（80：20）； 流速： 1.0 ml/min；检测波长214 nm；柱温70 ℃；灵敏度0.005AUFS ；进样量20 μl。
1.3 标准溶液的配置 精密称取CsA和CsD对照品用甲醇溶解，配置成浓度为25μg/ml 的CsA 标准溶液和浓度为25 μg/ml 的CsD 内标溶液，于4 ℃ 冰箱保存。
1.4 样品处理 取全血2 ml，加入内标溶液20 μl，0.1 mol/L NaOH 2 ml ，旋涡振荡30 s，加入重蒸乙醚6 ml，涡旋提取2 min，3 000r/min 离心15 min，取上清液在45 ℃ 水浴挥干，残渣用1 ml 正己烷70 μl 流动相和30 μl 0.1 mol/L 盐酸溶解后，旋涡振荡1 min，3 000 r/min 离心10 min，取下层液20 μl 进样。
2 实验结果
2.1 色谱行为 在所建立的色谱条件下，CsA和CsD有足够的分离度，且血中内源性杂质对测定无干扰。CsD和CsA的保留时间分别为8.5 min 和11.9 min，色谱图见图1。
2.2 标准曲线及最低检测限 取空白全血2 ml ，加入CsA 标准溶液，配置成浓度为50~600 ng/ml 的标准浓度系列，各加入内标溶液20 μl，按前述方法提取进样，在该浓度范围内，CsA 标准浓度（X ）对CsA 与CsD 的峰面积比值（Y）的线性回归方程为
Y=2.859 5×10-3X -0.041 7 r=0.999 8
本法全血中CsA 最低检测浓度为20 ng/ml。
2.3 回收率实验 配置含CsA 高、中、低三种浓度的全血样品，参照前述方法提取进样，做相对回收率实验，结果见表1，说明本法对全血中CsA 有较高回收率，且较为稳定，可作为常规检测方法。表1 环孢素A 的回收率实验结果
2.4 精密度实验 对100，200，400 ng/ml 三个标准浓度系列按前述方法处理，每天测定3次，连续测定3 d，测得日内和日间RSD分别为3.08%和3.94%，均<5%，表明本法重现性好，结果较为稳定。
2.5 干扰性实验 在上述色谱条件下，硫唑嘌呤，甲泼尼龙，头孢唑啉，阿莫西林等多种药物不干扰CsA 和CsD 色谱峰。
3 讨论
3.1 CsA的代谢物达20余种，HPLC法测定的是CsA原形药物浓度，其结果不受代谢物影响，而FPIA法测定的是原形药物和代谢物的总量，FPIA法测定的血药浓度明显高于HPLC法。
图1 环孢素A 高效液相色谱图
3.2 目前CsA的高效液相色谱测定方法样本处理过程复杂，给大量样本快速回报带来困难，本法经乙醚提取后直接挥干，然后加经盐酸酸化的流动相定容，正己烷除去脂溶性杂质后直接进样，大大减少了提取步骤和操作误差，缩短了时间。盐酸的量要严格掌握，过少杂质除不干净，过多易损坏柱子。
3.3 乙醚杂质过多，需重蒸处理，否则会使提取液两相界面不清，将水溶性杂质带过来，造成干扰。CsA不溶于正己烷，在酸性条件下用正己烷洗涤乙醚提取物，能够纯化样品，正己烷洗涤时振摇时间不要过长，否则易产生乳化现象。
【参考文献】
［1］ Borel JF.cyclosporines［J］. Transplant Proc，1989，21:810.
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