提到抗癌药物，人们大多会想到紫杉醇
制剂。紫杉醇是一种红豆杉属植物的次级代谢物。目前，不断增长的抗癌药物需求和红豆杉资源的缺乏，为紫杉醇的工业化生产带来了很大压力。据了解，目前从红豆杉树皮中提取得到的紫杉醇产量很低（0.004%~0.01%干重）；而紫杉醇复杂的化学结构意味着化学合成途径在经济上是难以推广的；紫杉醇的半合成原料，如从针叶红豆杉中分离得到的巴卡亭Ⅲ（baccatinⅢ），也需要从红豆杉属植物中提取。在这种情况下，利用细胞培养方法生产紫杉醇被公认为是有良好前景的供应途径。本文作者着重阐述了细胞培养中诱导子、剪切力和溶解氧等对紫杉醇产量的影响，以及利用生物反应器进行细胞培养时存在的问题，为探索工业化生产紫杉醇的最适宜条件和大规模细胞培养提供了理论参考。
——编者按
近年来，红豆杉培养物的分化研究引起了广泛的关注。大量的研究表明，植物细胞的分化与次生代谢物的合成有密切的关系。这些分化不但包括整个植株、器官、组织，还包括细胞和亚细胞水平的分化。分化的细胞、组织、器官往往有较高含量的次生代谢物。因此，在生物反应器中通过大规模培养分化组织、器官、甚至整个植株可以生产次生代谢物。目前，植物细胞培养所采用的培养物有细胞团块、绿色愈伤组织、冠瘿组织、不定芽（原基）、茎段、正常根、毛状根、畸形芽、胚（胚状体）甚至整个小植物。采用的反应器有：机械式搅拌反应器，如通气式搅拌反应器、转鼓式反应器等；气体驱动式反应器、气升内环流和外环流反应器；无搅动反应器，如灌注式反应器等。其中，气升式反应器较适合胚、茎和小植物的培养。
近两年，关于红豆杉细胞培养的研究从不同的角度揭示了红豆杉细胞、组织、器官的分化与合成紫杉醇的能力之间有一定的联系，但与其他植物细胞大规模培养的研究相比，这些研究还不够系统、完善。如据有关文献报道，研究人员Xu等发现圆球形、质地致密、表现出一定分化水平的自固定化红豆杉细胞，其紫杉醇的合成能力为疏松愈伤组织的5倍。Yukimune等最近报道，直径在0.1~1.0毫米以上的红豆杉细胞团块有利于紫杉醇的生物合成。他还在红豆杉悬浮细胞培养中发现，细胞聚集体的多少和紫杉醇的产量有明显的对应关系，提高细胞聚集体的生物量比能显著增加紫杉醇含量。另外，由于根是除树皮外紫杉醇含量较高的器官，有关研究人员还利用发根农杆菌侵染红豆杉的外植体以诱导毛状根，并采用毛状根进行紫杉醇的生产。这一培养系统无需外源激素，毛状根生长迅速，且
遗传性状稳定。最近，戴均贵等报道红豆杉和东北红豆杉幼苗下胚轴和胚根可以形成不定根。虽然不定根生长较慢，但合成紫杉醇的能力较愈伤组织强。Wann和Steven则利用胚性愈伤组织的畸形分化（PNE），诱导其产生类叶、类根等紫杉醇含量较高的器官，并进行大规模培养。该技术已获专利授权。
■添加诱导子可提高产量
提高红豆杉细胞的生长速率以及细胞中紫杉醇的含量是实现细胞培
养生产紫杉醇的关键。据文献报道，QianZG等在1升的气升式反应器中进行云南红豆杉细胞培养时发现，在第7天时加入100微摩尔的茉莉酸甲酯类似物DHP鄄JA（含有2个氢原子）和20克/升的蔗糖，再在第12天时加入100微摩尔的DHPJA，则云南红豆杉细胞的产量达到（738±41）毫克/升，生长速率达到33.2±1.9毫克/升·天。
Zhen-YuWang等研究了将茉莉酸甲酯和条件培养基共同加入对紫杉醇产量的影响。结果表明，当只加入条件培养基时，可增加细胞的生长速率，其值为0.125毫克/升·天；在第11天时，紫杉醇的最高含量为（5.4±1.2）毫克/克；细胞最大生长速率达到（4.5±1.2）毫克/升·天。然而，若是在第8天时加入100微摩尔的茉莉酸甲酯，则在第14天时细胞生长速率为0.162毫克/升·天，最大含量为（12.7±1.2）毫克/克，细胞最大生长速率为（11.8±0.9）毫克/升·天。
据有关文献报道，PanZ等比较了摇瓶和生物反应器中云南红豆杉细胞的生长情况。当将细胞从摇瓶转到反应器后，云南红豆杉的产量显著下降。他们通过改变搅拌式反应器的氧传递速率观察氧供应对于细胞生长和代谢的影响。结果发现，云南红豆杉细胞的积累量并没有太大的变化；改变剪切力的大小也没有产生相关变化。因此，云南红豆杉细胞产量的降低并不是由这两个因素所造成。而将不同浓度的乙烯在空气的
进口处加入，当乙烯的浓度由0增加到50ppm时，细胞的平均生长速率从0.146毫克/升·天增加到0.204毫克/升·天，云南红豆杉的紫杉醇含量和产量也显著提高。当乙烯的浓度为18ppm时，云南红豆杉的最高体积产量为163.7毫克/升，紫杉醇最高含量为13.28毫克/克。与不加乙烯的鼓泡式反应器相比，产量是其两倍。因此，从摇瓶培养到生物反应器培养的过程中，乙烯起到重要作用。
■剪切力和通气状况影响显著
XSun等利用旋转式反应器研究了剪切力对紫杉醇产量的影响。结果表明，在高剪切力条件下，紫杉醇的产量受到抑制，这可能是因为细胞受到了损坏，他们研究的最佳平均剪切速率是10.4/秒。
ShiZD等研究了植物细胞通过信号转导途径对剪切力进行反应的机制。当剪切率低于458/秒时，可增强初级代谢的进程，增加线粒体的活性和蛋白质的表达，并且可抑制苯丙氨酸裂解酶的活性（此酶与次级代谢有关）。当剪切率超过719/秒时，在一定程度上可损伤紫杉醇细胞，降低线粒体的活性，增加膜的渗透性，甚至会引起敏感细胞的反应，结果使苯丙氨酸裂解酶和细胞内的过氧化酶的活性增加，细胞外的酚醛累积，培养基被碱化。
Srinivasan等在比较250毫克摇瓶、搅拌式反应器（STB）和气动混合反应器（PMB）的培养效果时发现，虽然它们的动力学性质相同，但在PMB中细胞培养所得的紫杉醇含量达到1.5毫克/升，在摇瓶中为0.3毫克/升，而在STB中仅为0.1毫克/升。这些结果表明，培养环境的改变，特别是剪切力和通气状况等是从摇瓶到反应器放大过程中影响生物碱生成的主要因素。
■降低溶解氧利于紫杉醇生成
JLuo等在20升的生物反应器中研究了溶解氧对紫杉醇产量的影响。他们在最初20天的细胞培养中，将反应器中的溶解氧浓度控制在60%，然后在细胞培养的最后12天里，将溶解氧浓度降低到20%，结果得到紫杉醇的最大产量为18.7毫克/升。进一步的研究发现，在最后的12天用低浓度的溶解氧有利于生成紫杉醇的原因是，在这一时期，紫杉醇的合成大部分被氧饥饿所刺激或者是因为溶解氧的减少导致了挥发性气体——乙烯的增加，它作为胁迫因子刺激了紫杉醇产量的提高。
■反应器培养效果备受关注
从摇瓶到反应器，是红豆杉细胞培养产业化的必然途径。综合文献报道统计，现在已用于红豆杉细胞培养的反应器有：机械搅拌反应器、气升式反应器、威尔逊鼓泡式反应器、流化床反应器等。由于目前的反应器是从
微生物发酵培养用的反应器改造而来的，对于培养难度较大的红豆杉细胞还不太适宜，因此当前对反应器的研究势在必行。
国外研究人员Navia-OsorioA等在比较摇瓶和20升气升式反应器的培养效果后发现，紫杉醇产量从第24天到第28天时进入高产阶段，但是细胞生长速率在两种方式上没有明显的不同。当紫杉醇在反应器中达到最大产量时，它的细胞生物数量在干重上接近于在摇瓶中所培养的。研究人员认为，反应器比摇瓶能够提高紫杉醇产量的原因，可能主要是在生物反应器中有足够的通风，从而有利于充分的混合。
摇瓶对于实验操作而言，具有廉价、操作方便等优点，而对于应用于工业生产目的的反应器，威尔逊鼓泡式反应器因简单易行且可以连续操作而受到重视。Pestchanker等比较了摇瓶和威尔逊反应器中东北红豆杉细胞的生长情况，结果发现，培养21天后，两种反应器中紫杉醇的效价相同。在威尔逊鼓泡式反应器中，细胞对营养物质(糖、氮、钙等)吸收较快，21天时，细胞鲜重为135毫克/天，而摇瓶中细胞产量为310毫克/天。研究人员认为，这可能是由于威尔逊反应器器壁上易形成生长环带，影响了细胞鲜重的测定。Seki等证明，在灌注式培养反应器中，由于高度稀释，使细胞生长受到抑制。在培养第19天，稀释度为0.9升/天时，成批培养细胞比生长速率为2.1，而在灌注式培养反应器中培养细胞比生长速率为1.9。但与前者相比，后者紫杉醇的产量有所增加。
研究人员采用SonSH等研制的一种综合气升式和流化床反应器特点的发泡生物反应器培养红豆杉胚源细胞株时发现，在20升小规模培养反应器中培养的基础上，在100~150升反应器中培养具有良好的重现性，能够大幅度提高紫杉醇的产量。在培养27天后获得大约3毫克/升的紫杉醇和74毫克/升的总紫杉烷类物质。
■应用技术研究需深入
像其他植物细胞培养一样，从红豆杉细胞的摇瓶培养到反应器放大过程中存在着较大的难度。在摇瓶中能够培养成功，并不意味着在生物反应器上的放大培养能够成功。放大过程中存在许多未知的因素，如生物反应器的结构、生物反应器中培养液对细胞的剪切强度，传质、传热状态，以及植物细胞放大培养中通常存在的倍增时间延长、次生代谢物合成能力降低的问题。这些情况在不同的植物细胞培养中有很大的差别。另外，目前反应器生产的在线检测沿袭了微生物发酵培养检测体系，取样繁琐，很容易造成污染，特别是其忽略了植物细胞培养物中存在着不同分化程度的细胞聚集等因素。另外，利用个体细胞（团）质地、形态等分布规律，进行在线图像分析的研究在其他植物细胞大规模培养中已有进展，但是类似技术在红豆杉细胞培养中的应用还未见报道。根据植物细胞悬浮培养的特征，目前有必要加强对培养细胞（团）、组织水平的分化研究，了解细胞分化状态与紫杉醇含量之间的关系，并在生产中加以利用。 （吕晓辉 臧新 杨冬之）
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