白芍HPLC指纹图谱相似度的分析中药指纹图谱 | 39康复网

   白芍为毛贾科芍药Ynenniula cuf oraP all.的干燥根。药材主产浙江、安徽、四川等地，此外，河南、贵州、山东等地也有栽培lil。其味苦、酸，微寒.归肝、脾经。具有平肝止痛.养血调经，敛阴出汗之功能Cz;据报道，白芍根主要含有芍药昔、芍药内酚普、轻基芍药普、苯甲Wt芍药普和苯甲酞轻基芍药昔等昔类成分。目前，多用芍药昔这单一成分作为白芍的质控指标，难于全面的控制白芍的内在质量，不能对其真伪优劣做出判断。本实验通过用RP-HPLC方法建立白芍的指纹图谱，并将聚类分析和相似度分析的数据分析技术应用于白芍的指纹图谱，考察了白芍药材与产地及炮制之间的数据关系为全面控制白芍的质量提供了方法
    1 仪器与试药
    日本岛津公司LC一LOAD液相色谱仪，SPD一10A检测器，C一R6A数据理机1甲醇、乙睛为色谱纯，双蒸水，其他试剂均为分析纯。
    白芍药材均由沈阳药科大学孙启时教授进行鉴定，来源见表1（略）
    2 实验方法和结果
    2.1 对照品溶液的制备：精密称取芍药普对照品适量，用甲醇配制成。25 mg/ml的溶液。
    2.2 供试品溶液的制备
    2.2.1 提取方法的考察
    本实验对甲醇,95%乙醇索氏提取，甲醇,95%乙醇、丙酮-水(7:3) 回流提取，对提取溶剂、提取方法进行了考察。结果表明，乙醇回流提取后所得色谱峰的峰数为最多。后又对50%,75%,95%乙醇回流提取进行试验，发现三者之间峰数无显著性变化，本实验采用50%乙醇作为提取溶剂进行回流提取.
    2.2.2 样品溶液的制备
    精密称取白芍粉未1.09g加人50%乙醇10 mL回流提取3次，每次2 h,滤过，合井各滤液，旋转蒸发回收溶剂，残渣用甲醇溶解并定容置10 ML量瓶中，摇匀。再精密量取0.5 mL置5 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液备用。
    2.3 检测波长的选择
    取样品溶液，分别在210,230,254,282nm处检测。结果表明，254,282 nm处各色潜峰之间分离度好，但峰数少;210nm检测，蜂数与230 nm检测基本致，但基线不稳定，不能准确积分;以230。检测，峰数多，基线平稳，故选之。
    2.4 色谱条件
    HypersilC C18( 4.6mm×200mm,5um)，大连依利特科学仪器有限公司生产;流动相为乙腈-水(1288,H,PO,调pH二3.0);流速0.8 ml."miri};检测波长230nm，柱温为室温。
    2.5 系统适用性试验
    理论塔板数以芍药背计算不得低于5000，该峰与相邻色谱峰的分离度不得低于1.2。
    2.6 精密度试验
    精密称取18号样品，按供试品溶液制备方法制备供试品，连续进样5次，记录指纹图谱结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本致(RSD为。3%～2.8%)、符合指纹图谱要求，精密称取 18号样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试品，记录指纹图谱。结果表明，各色潜峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致(RSD)1.2%～4.3%)，符合指纹图谱要求。
    2.7 样品稳定性考察
    精密称取18号样品，按供试品溶液制备方法制备供试品，分别在。,2,4,8,16,24 h，记录指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致(RSD为0.8%一3.2%)，符合指纹图谱要求
    2.8 自芍的指纹图谱测定了28个白芍样品，共获得21个色谱峰。
    2.9 白芍样品相似度分析
    指纹图谱反映的是样品整体的特征.进行指纹图谱比较，可以反映样品之间的亲疏程度，但是单纯的直观比较指纹图谱的峰的多少和峰的大小，只是定性比较，而且又带有个人的主观性。相似度可以定量的描述指纹图谱，本研究用相似度分析对样品进行了比较，可以定量的、客观的对样品进行评价。首先对28个白芍样品进行聚类分析，采用离差平方和(Ward,5)法，利用欧氏距离(Eudid-)作为样品的聚类依据以峰面积为样品谱图的特征值，将样品分为3类。分类结果见表20结合生药学鉴定结果，并参考中国药品生物制品检定所的标准药材，从28个白芍药材中选取10个有代表性的合格药材(N,1 ,17 ,7,8,11,18,25,20,21,2)，取各样品中21个色谱峰峰面积的平均值作为共有模式，然后计算样品与共有模式之间的相似度，来判断样品质量。本研究以夹角余弦、相关系数和欧氏距离作为测度，分别计算各样品的相似度，结果见表3（略）。
    3 讨论
    3.1 本实验过程中，选择了多种流动相系统:①甲醇一水(H3P04调至不同pH);② 甲醇一乙睛一水(H3P04调至不同pH);③乙腊一水(H3P04调至不同pH) ;④乙腈一水一四氢峡喃(H3P04调至不同pH)。结果表明流动相以乙腊一水(H3P04调至州3.0)系统为最佳，各色谱峰分离度较好，保留时间适中。
    3.2 白芍中芍药昔的含量最高，因此，建立门芍指纹图谱时，发现供试品的浓度对指纹图谱中特征峰数目影响较大，
必须具有相当的浓度，才能检侧到指纹图谱中峰面积小的特征峰，否则就只能观察到几个主要峰，失去指纹图谱的意义
    3.3 目前，中药材的鉴别和分类很大程度卜还依赖于经验和表观分析，也缺乏从分析数据中获取评价依据的统一、使用的方法，采用本文的方法，可以快速获得不同样品间的相似性，进而利用聚类分析等方法对样品进行归类和鉴别。另外，在已建立标准指纹图谱的基础上可用相似度评价待测样品与用合格药材建立的共有模式指纹图谱之间的相似程度，在一定程度上反映了所测样品与合格样品的偏离程度，但是中药质量的评价仍需用代表临床药效的药理实验验证因此，如果结合白芍的药效物质基础和药理学研究，白芍的质量控制会更加完善和科学。

作者： 2006-3-27