南葶苈子HPLC指纹图谱的测定中药指纹图谱 | 39康复网

摘要:采用反相高效液相色谱法,对南葶苈子药材70%甲醇提取液的指纹图谱进行测定,建立南葶苈子药材HPLC指纹图谱。并与北葶苈子进行比较。结果表明,南、北葶苈子的HPLC图谱有区别。
关键词:高效液相色谱;南葶苈子;指纹图谱
葶苈子来源于十字花科植物独行菜L epidium apetalum W illd.和播娘蒿Descu rain ia sophia (L.)Webb.ex Prantl.的干燥成熟种子,分别习称为“北葶苈子”和“南葶苈子”。该药物味辛、苦,性大寒。归肺、膀胱经,具有泻肺平喘、利水消肿之功效。由于南葶苈子为当今的商品主流,根据南葶苈子的临床疗效而设计的哮喘呼吸道重要炎症介质-血小板激活因子( PAF)药理筛选实验表明,南葶苈子总黄酮成分为有效部位。经检索,目前关于葶苈子指纹图谱的测定未见报道。为了临床合理应用,并有效控制南葶苈子的质量,笔者利用反向高效液相法建立了南葶苈子的有效部位黄酮成分的指纹图谱,并用此法测定了3个商品北葶苈子的HPLC图谱,经分析指出了南、北葶苈子的主要区别。该方法具有较好的稳定性、重现性和可行性。
1 　仪器与试药
HP-1100型高效液相色谱仪, DAD 检测器,自动进样器,四元梯度泵,柱恒温箱,在线脱气机, HP化学工作站。TP300超声波清洗机(天鹏电子新技术(北京)有限公司。乙腈为色谱纯(美国Fisher公司) ,磷酸为分析纯(北京化工厂生产) ,甲醇为分析纯,水为超纯水。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷( Ⅰ) 、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷( Ⅱ) 、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷( Ⅲ) ,为笔者自南葶苈子中分离制备,纯度均在98%以上。葶苈子药材购自全国各药材公司、药店以及北京中医药大学中药鉴定室储存的标本,计25 个样品,均经王秀坤副研究员鉴定,见表1。
2 　方法与结果
2.1 　色谱条件　色谱柱Kromasil-ODS ( 5μm, 4.6×250mm) ;流动相CH2CN-H2O-H3 PO4 ,梯度洗脱见表2;流速1.0 ml/min;检测波长265 nm;柱温25℃;进样量20μl,色谱分析时间60 min。
2.2 　对照品溶液的制备　取对照品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ适量,以30%的甲醇溶解并稀释,制成每毫升中含Ⅰ83μg、Ⅱ 100 μg、Ⅲ 45 μg的溶液,作为对照品溶液。以0.45μg滤膜过滤。
2.3 　供试品溶液的制备　样品粉碎过60目筛,精密称取1.0 g,置50 ml锥形瓶中,加70%甲醇20ml,称重,超声波提取30 min,称重,以70%甲醇补足重量。过滤,弃掉5 ml初滤液,取续滤液10 ml,以0145μm滤膜过滤。
2.4 　稳定性试验　取同一药材(样品编号为22)供试品溶液,分别于0、1、2、4、12、24 h进样,各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD均小于1% ,表明样品在24 h内稳定。
2.5 　精密度实验　取同一药材(样品编号为22)供试品溶液连续进样5次,各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD均小于1% ,符合指纹图谱的检测要求〔1〕。
2.6 　重现性试验　取同一批药材(样品编号为22) 5份,分别精密称定,按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液5份,分别进样检测。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD 均小于1% ,符合指纹图谱的检测要求〔1〕。
2.7 　南葶苈子HPLC指纹图谱的测定与确定　按上述液相色谱条件测定了22份南葶苈子商品药材(样品编号为1～22) ,根据各样品图谱中色谱峰相对保留时间,确定共有峰,计算峰面积比值,共有峰经紫外光谱检测均为黄酮成分,建立了南葶苈子药材的指纹图谱。结果见图1及表3～4。
3 　北葶苈子HPLC图谱的测定及南、北葶苈子图谱的比较
按上述色谱条件测定了3份北葶苈子商品药材(样品编号为23 ～25 ) , 见图2。将北葶苈子的HPLC图谱与南葶苈子指纹图谱比较,得出南、北葶苈子图谱的主要区别(表5) 。
4 　讨论
4.1 　选择色谱条件时,流动相选择了CH3OH-H2O和CH3 CN-H2O-H3 PO4 两种系统进行梯度洗脱。结果表明, CH3 CN-H2O-H3 PO4 系统梯度洗脱为佳。对比了350 nm, 260 nm和265 nm,结果发现265 nm测定的色谱图,出峰较多,各色谱峰之间分离度较好,保留时间适中,故采用265 nm为检测波长。
4.2 　南葶苈子HPLC指纹图谱的特征峰1 ( S) 、3、4的化学结构分别是槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷( Ⅰ) 、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷( Ⅱ) 、异鼠李素-32-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷( Ⅲ) 。而北葶苈子HPLC指纹图谱中则无以上峰。
4.3 　南葶苈子与北葶苈子的HPLC图谱存在较大的区别,该方法可以很好的区分南葶苈子和北葶苈子。南葶苈子与北葶苈子来源不同,应分别进行指纹图谱的研究。
4.4 　通过紫外光谱检测,南葶苈子共有指纹峰及39～45min之间的主要色谱峰均具有黄酮类化合物的两个特征谱带。根据39～45 min之间的几个峰的有无,是否可以鉴别产地不同的南葶苈子,还有待进一步研究。

作者： 2006-3-27