林蛙油的指纹图谱

摘要:目的：建立一种稳定、可靠的鉴别和控制林蛙油质量的方法。方法：利用高效液相色谱法,测定10批林蛙油药材建立指纹图谱。色谱条件:Dimonsil C18分析柱(250mm×4.6mm,5μm),柱温:25℃, 流动相:乙腈-水(50∶
50),分析时间60min。结果：测10份不同林蛙油商品完整药材的丙酮提取物的HPLC图谱。结论：在本色谱条件下, 可以检出17个相应位置稳定的共有峰, 可作为确定鉴定林蛙油的指标峰。
关键词:指纹图谱;高效液相色谱法;林蛙油
林蛙油是两栖纲无尾目蛙科蛙属动物中国林蛙Rana temporaria chensinesis David 雌蛙的干燥输卵管,是传统的名贵中药,具有健脾胃、滋阴补肾、润肺生津之功效,对体虚气弱、气血亏损、精力耗损、记忆力不佳、神经性头痛、神经衰弱均有疗效。林蛙油的活性成分分为两部分:水溶性成分(蛋白质和氨基酸) 和脂溶性成分(脂肪、维生素A、胆固醇、甾体激素类等)。其能够增加机体的免疫能力,且有镇咳祛痰作用。目前,林蛙属于国家保护动物,严禁滥捕乱杀,而林蛙油市场需求量不断增加,市场上林蛙油的价格居高不下,因此出现许多伪品,如中华大蟾蜍的输卵管、青蛙油等,为此建立一个完整的质量标准体系是十分必要的。本实验选用不同产地及不同药店的10种林蛙油完整商品药材,通过HPLC指纹图谱建立起评价林蛙油质量的方法。
1　仪器与试药
Water-515 高效液相色谱仪(包括515-HPLC泵、Wates双波长紫外检测器、Millog工作站)。甲醇、乙腈为色谱纯, 其余试剂为分析纯、去离子水。参照物: 酪氨酸(中国药品生物制品鉴定所, 872-200205);10批林蛙油,来源于不同产地,分别为:黑龙江省伊春金山林蛙养殖场(1号)、黑龙江省宾具林蛙养殖场(2号)、黑龙江省中药联营公司(3号)、黑龙江省药材联营公司(4号)、黑龙江省绥滨林蛙养殖场(5号)、哈尔滨市世一堂药店(6号)、吉林省
桦甸林蛙养殖场(7号)、吉林省江石林蛙养殖场(8号)、吉林省二道白河林蛙养殖场(9号)、吉林省百姓大药房(10号)。经哈尔滨滨商业大学药学院中药鉴定教研室鉴定均为正品。
2　方法与结果
2.1　色谱条件:色谱柱Dimonsil C18 分析柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(50∶50);体积流量:0.5mL/min;检测波长: 280nm;柱温:室温25℃。
2.2　供试品溶液:取林蛙油粉末1g,用索氏提取器丙酮提取6h后,减压蒸干丙酮,残留物用色谱甲醇定容到10mL 量瓶中,密封,置冰箱中备用。
2.3　精密度试验:取2号林蛙油药材粉末按2.1项下方法制备供试品,精密取20μL 重复连续进样5次,检测1h 的指纹图谱。结果表明:各峰的相对保留时间一致,RSD< 1% ,而各峰的相对面积比值大体一致, RSD< 5% ,符合指纹图谱的要求。
2.4　稳定性试验:取3号林蛙油粉末按2.1项下方法制备, 取20μL在1d内进样5次,检测1h指纹图谱。结果表明: 各色谱峰相对保留时间一致,RSD<1%,各峰相对积分面积大体一致,RSD<3%。由此可知常温下1d保持较好的稳定性。
2.5　重现性试验:取3号林蛙油粉末5份,按2.1项下方法平行制备供试品。取20μL进样,检测1h的指纹图谱, 结果表明:各色谱峰的相对保留时间和主要峰面积比值大体一致,其RSD<3%。
2.6 　林蛙油原药材的HPLC指纹图谱及技术参数。
2.6.1　分析方法:精密吸取1～10号林蛙油供试品各20μL,在上述色谱条件下进样,记录HPLC色谱图,计算样品中各色谱峰相对保留时间(RT)及相对峰面积比值RA。
2.6.2　共有峰确定:在1～10号林蛙油供试品的HPLC 指纹图谱中由相对保留时间比较稳定的色谱峰(RSD≤3%) 可以确定的主要共有峰有17个, 其平均保留时间在0.6544～6.256,RSD< 2.9%。分别为峰3、4、S、6、7、12、14、15、18、20、21、23、26、27、28、30、31, 林蛙油的HPLC 指纹图谱见图的为共有峰)。
2.7　对照指纹图谱的制定:本实验不存在超长样本,因此选用共有模式生成法即平均矢量法。通过一系列色谱指纹图谱的研究,模拟出对照指纹图谱或生成对照指纹图谱的数据,即共有模式生成法,该方法综合了所有样品的指纹图谱信息。
2.8　指纹图谱中色谱峰的重叠率:峰重叠率是在两个相互比较样品的各自峰数及两者共有峰数(指α值相同的峰) 的基础上,从质的角度上考虑其相关性。
重叠率=[待测样品与对照品共有峰×2/待测样品的峰数+对照品的峰数]×100%
由此,重叠率的计算是以建立的对照指纹图谱为基准,将其出峰数目和欲对比样品的出峰数之和作分母,两者具有相同的A值之和作分子,以此分别求出10个样品的重叠率。从表中可以知道10批林蛙油的指纹图谱与对照指纹图谱十分接近。
3　讨论
对中药复杂体系的质量控制是中药现代化研究的关键问题,本实验以林蛙油为例应用反相高效液相色谱技术, 建立了林蛙油指纹图谱控制林蛙油的质量。
3.1 　流动相的选择:选用了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水(含二乙胺) 等体系进行洗脱, 结果以乙腈-水体系得到的色谱峰形较好,且较稳定。为了得到更好的分离度, 选用乙腈-水(25∶75)、乙腈-水(50∶50)、乙腈-水(75∶25)3种流动相的组合。结果在280nm处,乙腈-水(50∶50)的系统为最佳,分离度较好,保留时间适中,因此选用此作为林蛙油HPLC指纹图谱检测的流动相。
3.2　检测波长的选择: 本试验选用208、254、280nm3种波长,在208nm有多个峰出现,但是其属于末端吸收,溶剂对其有影响;在254nm的峰较少;在280nm有多个峰出现而且峰形也较好,同时结合所含主要成分(参照对照品)在280nm处有最大吸收,因此选用280nm作为林蛙油的HPLC的指纹图谱检测波长。
3.3　参照峰的选择;在指纹图谱中一般选择比较大的且稳定的峰作为参照峰,其中林蛙油的指纹图谱中酪氨酸的吸收峰最大而且稳定,因此选择此峰为林蛙油指纹图谱的参照峰。