摘要:含106个细胞液加等量纯化溶液[4mol/L胍基硫氰酸盐,25mmol/L柠檬酸pH7。3ml纯化溶液,重复3)步骤,离心10分钟,弃上清液。
07-09-25摘要:用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl 10mmol/l pH7。4,EDTa 1mmol/L pH8。0)调整细胞为2×107个(组织应切碎置液氮冰冻,高速搅切成粉末后,加入缓冲液)。加1/10-1/20体积(V)10mg/ml蛋白酶(Sigma Ⅷ型)...
07-09-25摘要:用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶,一般200~400bp的DNA片段,可配制1。7%浓度的琼脂糖用于电泳。5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中,称取一定量的琼脂糖粉放入后沸...
07-09-25摘要:异硫氰酸胍法提取制备模板核酸此法主要用于RNA的提取。异硫氰酸胍消化液异硫氰酸胍4mol/L柠檬酸钠(PH7。消化方法:用50~100ul细胞悬液及血清,加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后,或65℃1小时,或室温放置数分...
07-09-25摘要:标本(组织细胞,分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后,加消化 裂解液20~50ul(0。5%吐温-20),95~98℃,15~30min以裂解病原体,裂解细胞。5%2-ME做裂解 液,95℃30min消化处理,离心取上清,PCR扩增检测HBV DNA。
07-09-25摘要:多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段45—50nt的发夹结构RNA(small hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达,shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA,从而引发基因沉默或者...
07-09-25摘要:其他制备siRNA的方法都需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个最有效的siRNA。而用RNaseIII降解长片断双链RNA成为siRNAs库就象制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”,RNase III的完全降解产物(12—15bp)同...
07-09-25摘要:体外转录合成siRNAs,其成本相对化学合成法比较低,是一种相对性价比高的筛选siRNAs的好方法,而且要比化学合成法更快的得到siRNAs。一旦得到DNA 双链模版(这个还是需要DNA合成的,不过DNA合成的成本就比较低了)...
07-09-25摘要:在较早的哺乳动物RNAi实验中,siRNAs是通过化学方法合成的,就像合成引物一样,是应用起来最方便的一种方法,研究人员几乎不需要做什么工作。但是RNA合成成本高,定制周期长,特别是有特殊需求的RNA序列。由于价格...
07-09-25摘要:问:如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的,该怎么办。一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。但同时必须作杂交对照实验。
07-09-25摘要:对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列为了找到潜在靶位点,扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。如果可能,siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。美国著名RNA产品公司Ambio...
07-09-25摘要:(一)试剂1。 试剂甲:碱性铜试剂溶液中,含0。 试剂乙:与前面的基本法相同。只是试剂甲改为1毫升,室温放置10分钟后,试剂乙改为4毫升。
07-09-25摘要:过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量...
07-09-25摘要:蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成...
07-09-25摘要:在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的...
07-09-25摘要:(一)实验原理双缩脲法(Biuret法)和Folin—酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白质与染料...
07-09-25摘要:用 Trypsin 酶解蛋白质时,碳酸氢氨的浓度应该是多少。
07-09-25摘要:组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落原位杂交不同,菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交,而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探...
07-09-25摘要:Northern印迹杂交(Northern blot)。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术,RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂...
07-09-25摘要:Southern印迹杂交(Southern blot)是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶...
07-09-25摘要:斑点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上,烘烤固定。一张膜上可同时检测多个样品,为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔,样品...
07-09-25摘要:菌落原位杂交(colony in situ hybridization)。是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA,将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号、并与主...
07-09-25摘要:1.DNA的变性解链是杂交成功的关键,Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性,但强酸会使核酸降解。碱变性可避免DNA的降解、热变性要在低DNA浓度...
07-09-25摘要:1 原位光刻合成寡聚核苷酸原位光刻合成技术是由Affymetrix公司开发的,采用的技术原理是在合成碱基单体的5‘羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护,然后一个5‘端保护的核苷酸单体...
07-09-25摘要:1)离心沉淀cDNA第一链,并重悬在50μl水中,加50μl 2×第二链缓冲液(0。2mol/L Hepes,pH6。9,20m mol/L MgCl2,5 m mol/L DTT,0。14 mol/L KCl,1 m mol/L 4种Dntp),混合均匀。
07-09-25摘要:通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后,变可进行cDNA第一链的合成,其步骤包括:1)在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl(10μg),100m mol/L甲基氢氧化汞1μl,室温反应l0分钟...
07-09-25摘要:采用RNA变性电泳法检测RNA质量,方法如下:⑴ 凝胶制备:制备1。2%琼脂糖凝胶(电泳槽体积为50ml)① 称取0。② 加入5ml 10×甲醛变性电泳缓冲液,并加入1。③ 倒入电泳槽中制胶(甲醛有毒,制胶应在通风橱中进行)。
07-09-25摘要:使用法玛西亚公司的DNA/RNA浓度测定仪,测定样品A260和A280值。根据A260/ A280比值,估测RNA质量。在100μl RNA原液中取1μl稀释至250μl(DEPC处理的水),测定样品的A260和A280的值,按下列公式计算其浓度:RNA...
07-09-25摘要:1 质粒DNA的提取质粒DNA是细菌细胞中小的共价闭合环状双链DNA。由于基因工程中使用的载体主要是质粒,因此,质粒DNA的提取和纯化是进行基因工程的重要前提。提取质粒DNA的方法很多,下面介绍几种有代表性的程序。...
07-09-25摘要:1.体细胞杂交法 体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞。将从身体分离的体细胞做组织培养进行遗传学研究的学科称为体细胞遗传学(somatic genetics)。体外培养细胞可人为控制或改变环境条件,并可建立细胞株,长...
07-09-25摘要:1 基因芯片技术分离目的基因生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。基因芯片是生物芯片的一种,其上固定的是核算类物质,主要用于DNA、RNA分析。分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某...
07-09-25摘要:随着PCR技术的发展,人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)、以及进一步改进的代表性差示分析(RAD),抑制性扣除杂交(SSH)和交互扣除RNA差别显示技术(RSD...
07-09-25摘要:(1) 目的基因组DNA片段的制备基本原则:DNA片段之间存在部分重叠序列。
07-09-25摘要:1 从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中。1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上 ,4℃4000转 /分离心10min,...
07-09-25摘要:在RNA凝胶电泳之前,先用乙二醛等变性剂处理RNA,再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。RNA变性吸取1μl 80mmol/L磷酸缓冲液,1μl RNA样品(最多100μg),2μl,4mol/L 乙二醇,4μl二甲基...
07-09-25摘要:DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后,放入碱性溶液中使其变性,将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上,然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱...
07-09-25摘要:1、 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个...
07-09-25摘要:coli TG1单菌落,接种于5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,取50ul培养液转入5ml LB中,37℃振荡培养1~1.5小时至对数生长期OD600=0.5左右。2、 感受态细胞的制备⑴、将培养液1.5ml转入离心管中,冰...
07-09-25摘要:pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性,不出现扩增条带pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性④pcr循环条...
07-09-25