静脉注射免疫球蛋白对新生儿脐血单个核细胞活化增殖的影响

静脉注射免疫球蛋白对新生儿脐血单个核细胞活化增殖的影响

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 基础免疫学

作者：李庆生　吴圣楣　应大明　林梓

单位：200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科研究所

关键词：免疫球蛋白类；静脉内；单核细胞；胎血

　　【 摘要 】　目的　探讨静脉注射免疫球蛋白（IVIG）对新生儿单个核细胞活化增殖的影响。方法　运用光学显微镜及³H-TdR掺入法观察IVIG对脐血单个核细胞（CBMC）形态学的影响及对CBMC增殖的调节。结果　IVIG使CBMC的母细胞化减少, 细胞代谢的速度减慢。IVIG使CBMC的³H-TdR掺入率下降更加明显地反映了IVIG对CBMC增殖的抑制。IL-2或IL-2联合IL-4可以拮抗IVIG对CBMC增殖的抑制。结论　IVIG并非直接抑制CBMC的活化或干预由IL-2与IL-2R相互作用所介导的增殖反应。IVIG可能通过抑制细胞因子的产生而阻碍CBMC的增殖反应。

　　Modulation of intravenous immunoglobulin on the proliferation in neonatal mononuclear cell　LI Qingsheng, WU Shengmei, YING Daming, et al. Xinhua Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute for Pediatric Research, Shanghai 200092

　　【 Abstract 】　Objective　To determine the probable regulatory effects of intravenous immunoglobulin(IVIG) on the proliferation of neonatal mononuclear cells.Method　To observe the influence of IVIG on the cord blood mononuclear cells (CBMC) proliferation with both microscopy and the ³ H-TdR incorporation test.Results　Both cell metabolism and blast transformation of CBMC diminished significantly in the IVIG-exposed cells in comparison with the controls. This was further confirmed by ³ H-TdR incorporation rates which reflected the inhibitory effect of IVIG on the CBMC proliferation more clearly. Addition of either rIL-2 or the combination of rIL-2 and rIL-4 could antagonise the IVIG-induced inhibition.Conclusions　 Since IVIG did not appear to interfere with either the activation process or IL-2 mediated DNA synthesis and IL-2 receptor interaction of CBMCs, IVIG may inhibit CBMC proliferation, indirectly, through its interference with the production of cytokines

　　【 Subject words 】　Intravenous immunoglobulin　　Mononuclear cell Fetal blood

　　随着静脉免疫球蛋白（intravenous immunoglo-bulin, IVIG）适应症的不断扩大, 对其作用机制的研究亦有了飞速的发展, 但IVIG对体外T细胞功能调节的研究仍不多见, 尚未见IVIG对脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cell, CBMC）活化增殖调节的报道。运用植物血凝素（PHA）活化诱导CBMC， 我们观察了IVIG及添加IL-2、IL-4下的IVIG对CBMC活化增殖的影响。

　　材料与方法

　　1.材料：脐血标本取自足月新生儿娩出时近胎盘端脐静脉血。成人外周血取自健康成年自愿者。

　　IVIG溶液配制：IVIG干粉（Gammgard）为Baxter Healthcare公司（CA）产品，实验前用RPMI 1640溶解并正压过滤, IVIG的终浓度为5mg/ml。

　　2.方法： 经密度梯度离心法分离得CBMC（10⁶/ml）或成人外周血单个核细胞（PBMC，10⁶/ml）， 200μl/孔CBMC（或PBMC）接种于96孔细胞培养板中，实验组与正常对照组分别加入IVIG或等量的RPMI　1640，细胞培养的同时加入PHA-P（25μg/ml， Sigma）， 两组均予以IL-2（100U/ml,13.1×10⁶U/ml, Takeda Co., Japan）, IL-4（10ng/ml, 5×10⁶U/mg, Gibco）及其组合的干预, 设3复孔进行, 细胞培养72小时， 在培养结束前6小时加入1μCi(3.7×10⁴Bq)/孔的³H-TdR（中科院上海原子核研究所）,收获细胞， 用YJS-80型液闪仪（中国科学院上海原子核研究所）检测每分钟脉冲数（cpm）。

　　3.数据统计：数据以均数±标准差表示， 使用Stastictica 5.0经配对 t检验方法分析实验数据。

　　结　果

　　1.IVIG抑制体外PHA诱导的CBMC增殖： 在未加入IVIG的培养基中， PHA刺激的单个核细胞培养24小时左右后，培养基的颜色由粉红色转变为淡黄色，这是细胞代谢增加的结果。而在加入IVIG的培养基中，上述培养基颜色的变化推迟， 培养基颜色的转变程度也不及前者， 母细胞化细胞数目减少，体积也较小。用台盼蓝染色并没有发现细胞存活率下降的表现。进一步通过³H-TdR掺入率测定检测IVIG的抑制作用。IVIG对CBMC及PBMC的活化增殖均有不同程度的抑制作用（见表1）。

　　　　　　表1　IVIG抑制经PHA刺激的CBMC和PBMC的³H-TdR掺入率(cpm)

　　Table 1. IVIG inhibits ³ H-TdR incorporation rates (cpm) of CBMC and PBMC　stimulated by PHA

Condition	CBMC(n=8)				PBMC(n=5)
	-IVIG	+IVIG	t value	P value	-IVIG	+IVIG	t value	P value
Medium	624±279	499±228	2.1035	0.0735	469±215	469±215	2.6976	0.0542
PHA	17054±7759	13330±3265	1.6592	0.1410	31986±3616	31986±3616	4.6795	0.0095
IL-2	6349±1355	5171±1080	2.8697	0.0240	7869±909	7869±909	3.5207	0.0244
IL-4	4631±812	4005±456	1.5879	0.1563	5910±267	5910±267	4.932	0.0078
PHA+IL-2	30330±3223	22365±3580	7.0766	0.0001	58763±4801	58763±4801	6.8710	0.0023
PHA+IL-4	19219±2186	12858±2565	7.5424	0.0001	35066±5707	35066±5707	3.0625	0.0375
PHA+IL-2+IL-4	42237±6733	32238±3271	3.7232	0.007	65665±7275	65665±7275	3.6678	0.0214

　　 2.IL-2拮抗IVIG对CBMC增殖的抑制：在表1中， IL-2或IL-4可诱导单个核细胞出现轻度的增殖反应，表2示IL-2可以拮抗IVIG对PHA诱导的CBMC增殖的抑制；IL-4却不能拮抗IVIG的抑制作用；但IL-2联合IL-4的效应比单独应用IL-2的效应强（PHA+IL-2+IVIG:PHA+IL-2+IL-4+IVIG, P=0.0018）。向含或不含IVIG的培养基中加入IL-2, IL-4或 IL-2+IL-4对培养基的颜色及低倍镜下（～×10, ～×25）的细胞形态学变化影响不明显。　　　　　　　表2　IL-2或IL-4对IVIG抑制CBMC和PBMC的拮抗效应比较

　　Table 2. Comparison of antagonistic effect of IL-2 or IL-4 on the IVIG-induced inhibition between CBMC and PBMC

Group	PHA+IVIG	IL-2+PHA+IVIG	IL-4+PHA+IVIG	p1	p2
CBMC(n=8)	13330±3265	22365±3580	12858±2565	0.0011	0.7229
PBMC(n=5)	20107±2717	40517±5668	25245±4996	0.0035	0.2088

　　p1,p2:Comparison between PHA+IVIG and IL-2+PHA+IVIG

　　讨　论

　　T细胞的增殖反应类似于其它类型的细胞, 从大体上可分为两个阶段, 即静止细胞（G0期）进入G1期的活化阶段, 以及有DNA合成的增殖阶段。在活化阶段, 细胞表达生长因子受体及对某些生长因子的识别反应。在增殖阶段, 有丝分裂原触发IL-2 mRNA的转录及IL-2的释放。我们的结果表明, 单独的IL-2或IL-4可诱导单个核细胞出现轻度的增殖。 另有研究表明， 只有在有丝分裂原诱导细胞进入活化阶段后, IL-2或IL-4才能发挥各自的刺激功能^〔1〕。IVIG抑制PHA刺激下CBMC的增殖，同样在IVIG存在的条件下，IL-2或IL-2联合IL-4的添加却明显提高了CBMC的³H-TdR掺入率。这一结果提示IVIG并不能抑制CBMC的活化，也不能干预由IL-2与IL-2R相互作用所介导的增殖阶段DNA的合成反应。IVIG对CBMC增殖的抑制可能间接源于对活化后增殖阶段部分细胞因子（如IL-2或IL-4）产生的抑制，或源于对增殖阶段IL-2与IL-2R相互作用所介导的DNA合成之外的其他影响DNA合成因素的干预。支持这一推论的另一证据是向培养中的EB病毒转染的B细胞株及红白血病细胞株中加入IVIG, 用5-溴脱氧尿核苷试验检测细胞周期, 发现IVIG的加入使两种类型的细胞均被阻止在G0/G1期, 而不能进入S期（无DNA合成）^〔2〕。应当注意的是，脐血单个核细胞中的T细胞（CD3⁺T细胞、CD3⁺ CD4⁺ T细胞、CD3⁺ CD8⁺ T细胞）百分比及绝对值均与成人外周血中的相应值有一定的差异^〔3〕，且脐血单个核细胞中含有一定量的造血干细胞及祖细胞。今后应采用脐血中纯化的T细胞及其某一亚群进行有关活化增殖的检测。

　　本次研究中, 单独的IL-4并不能明显地改变IVIG对PHA诱发CBMC增殖的抑制反应。这与先前的结果不一致, Amran等^〔4〕发现IL-4可以拮抗IVIG对活化T细胞增殖的抑制。已经知道IL-4能够诱导人或鼠类T细胞增殖的反应。在一些模型中, IL-4的这种诱导作用不需要IL-2的存在, 而在另外的研究中， IL-4的促增殖作用必须通过IL-2的中介才能实现。亦有研究表明，IL-4能抑制IL-2R的表达及IL-2依赖性的人类T细胞的增殖。 为何本次实验中的外源性IL-4不能拮抗IVIG对CBMC增殖的抑制？这可能与不同的T细胞亚群对IL-4的反应不一致有关^〔3〕。与成人相比, 新生儿T细胞表现出"幼稚"型^〔5〕。也不排除活化的成人T细胞具有更高水平的IL-4R^〔4〕。

　　本课题受国家自然科学基金项目资助（项目编号:39600158）

　　参考文献

　　[1]Saloga J, Schwinzer R, Renz H, et al. Characterization of the progression signal for human T-cell proliferation provided by monoclonal antibodies to the CD3-TCR complex. Clin Immunol Immunopath， 1993， 67（3）∶ 232-239.

　　[2]Van Schaik NV, Lundkvist I, Vermeulen M, et al. Polyvalent immunoglobulin for intravenous use interferes with cell proliferation in vitro. J Clin Immunol， 1992， 12（5）∶ 325-334.

　　[3]Comans-Bitter WM, de Groot MR, den Beemd R, et al. Immunopheontyping of blood lymphocytes in childhood. J Pediatr, 1997, 130(3)∶388-393.

　　[4]Amran D, Renz H, Lack G, et al. Suppression of cytokine-dependent human T-cell proliferation by intravenous immunoglobulin. Clin Immunol Immunopath, 1994, 73（2）∶180-186.

　　[5]Schwinzer R, Franklin RA, Domennico J, et al. Monoclonal antibodies directed to different epitopes in the CD3/TCR complex induce different states of competence in resting human T cells. J Immunol, 1992, 148(5)∶ 1322-1328.

(收稿：1997-12-14　　修回：1998-04-27)