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HLA-A匹配的人胃癌细胞系诱生胃癌特异性T淋巴细胞
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 肿瘤免疫学
作者：聂勇战 吴开春 田凤岐 李玲 陈宝军 乔泰东 樊代明
单位：第四军医大学附属西京医院消化疾病研究所
关键词：HLA抗原；T淋巴细胞；胃肿瘤
【 摘要 】 目的 用HLA-A匹配的人胃癌细胞系诱导对胃癌细胞具有特异性杀伤作用的T淋巴细胞。 方法 分离胃癌患者及正常人外周血淋巴细胞(PBL)，用HLAⅠ类型别已知、经照射的异体胃癌细胞系刺激，进行筛选性的混合淋巴细胞肿瘤细胞培养（MLTC），初步获得HLA-A可能匹配的淋巴细胞供体，血清法测定其HLA-A、B分子确认匹配后，进一步进行MLTC，3H掺入法评估其增殖能力，直接免疫荧光法分析其细胞表型，51Cr释放试验检测效应细胞的杀伤效应。 结果 从9例(共分离11次)胃癌患者及10例(共分离16次)正常人PBL中，初筛发现有2例胃癌患者及1例正常人PBL得以大量增殖，检测出其中1例胃癌患者及正常人的HLA-A抗原均为HLA-A2、A24，与用作刺激的异体胃癌细胞系相匹配，1例则不相匹配。对匹配的PBL进一步实施MLTC，经3～4次刺激后， CD3＋淋巴细胞达到98％，其对HLA-A匹配胃癌细胞的杀伤表现出明显的特异性。 结论 利用HLA-A2（A24）匹配的异体胃癌细胞系作为刺激细胞反复诱导胃癌患者或健康人PBL，有可能产生胃癌特异性的CTL。推测在刺激及培养条件适宜时，人外周血中较少的CTL前体细胞(CTLp)是可能捕捉到的。
Induction of tumor specific cytotoxic T lymphocytes from
human peripheral blood by stimulation with HLA-A
matched allogeneic gastric tumor cell lines
NIE Yongzhan, WU Kaichun, TIAN Fengqi, et al. Department of Gastroenterology,
Xijing Hospital, Xi'an 710032, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To generate tumor specific cytotoxic T lymphocytes from human peripheral blood by stimulation with HLA-A matched allogeneic gastric tumor cell lines. Methods Peripheral blood lymphocytes (PBL) were isolated from 9 patients for 11 times with gastric carcinoma and from 10 healthy subjects for 16 times. Preliminary mixed lymphocyte tumor cell cultures (MLTCs) were performed to screen the HLA-A matched lymphocytes by using irradiated known HLA-A allogeneic gastric tumor cell lines in the presence of 50U/ml of IL-2. The selected proliferative lymphocytes were typed for HLA-A,B antigens. Lymphocyte proliferation in response to tumor cells was studied by 3H thymidine incorporation. Phenotype was characterized by direct immunofluorescence using flow cytometer. The 51Cr release assay was used for determination of lymphocyte cytotoxic activity. Results Lymphocytes from 2 patients and 1 healthy subject had marked increase in proliferation after the culture. Their HLA-A antigens were found to be matched with known HLA-A antigens of the allogeneic gastric tumor cell lines in one healthy subject and one patient. MLTCs were further cultured (with 3-4 pulse of the tumor cells) to obtain cytotoxic lymphocytes. An increased expansion of the lymphocytes which contained 98% CD3+ cells was achieved (up to 20-100 folds). These T lymphocytes showed specific cytotoxicity to the HLA-A matched gastric cancer cells. Conclusions Gastric cancer-specific cytotoxic T lymphocytes could be obtained from PBL by stimulation with allogeneic gastric tumor cell lines, which suggests that PBL from patients with gastric carcinoma and healthy subjects contain CTL precursors (CTLp) for generating antitumor CTL.
【 Subject words 】 HLA antigen; T lymphocyte; Stomach neoplasms
在人恶性肿瘤的细胞免疫研究中，用低剂量IL-2诱导和自身癌细胞重复刺激产生自身肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），在黑色素瘤、肾癌、乳腺癌等多种实体肿瘤已成功用于临床。这些特异性CTL具有严格MHC限制性〔1-3〕。在起初的研究工作中，作为被诱导的对象，人们主要着眼于瘤组织或浸润淋巴结中的浸润淋巴细胞（TIL, tumor infiltrating lymphocyte）或腹水中的肿瘤相关淋巴细胞(TAL, tumor associated lymphocyte)，以后扩展至患者甚至健康人外周血淋巴细胞〔2〕，已取得初步进展。
更进一步，人们利用异体黑色素瘤细胞系成功诱导了对自体瘤细胞具有特异性杀伤作用的CTL，其杀伤活性及特异性与用自身黑色素瘤诱导的CTL无明显差别,并逐渐拓宽至脑胶质瘤、白血病的研究〔3-7〕。
建立肿瘤特异性的CTL是胃癌细胞免疫研究得以深入的前提条件，以自身胃癌细胞为刺激细胞，通过MLTC建立CTL及其克隆，虽有个别成功的报道〔8〕，但不能成为常规，主要原因在于：要从胃癌组织同时分离获得TIL和胃癌细胞，并得以成功传代培养是极其困难的〔9〕。本研究借鉴此方面对其它肿瘤研究的成功经验，利用经照射HLA-A匹配的异体胃癌细胞系作为刺激细胞，通过MLTC的方法，诱导胃癌特异性或相关的T淋巴细胞，并对其特性加以鉴定。
材料与方法
细胞系：胃癌细胞系，KATO-3、MKN45、SGC7901均系本所细胞库冻存。K562，人髓样白血病细胞系，为NK细胞的靶细胞。骨肉瘤细胞系由本校实验动物中心提供。人成纤维细胞，本院烧伤科实验室提供。
淋巴细胞分离：常规方法分离其中淋巴细胞，收集入25ml培养瓶，25min后吸取非贴壁细胞入另一5ml培养瓶，培养介质为RPMI 1640，含10%已灭活的混合人AB型血清。
HLA-A、B抗原血清分型：由西安医科大学法医学院采用NIH标准分型板（Roche Image Analysis Systems, Burlington N.C.），借助微量细胞毒实验，对淋巴细胞和肿瘤细胞进行HLA-A、B抗原分型。
混合淋巴细胞肿瘤细胞培养：淋巴细胞自分离第4天以5×105/cm2的起始密度培养于24孔板中，瘤细胞计数后60Co照射150Gy(1Gy=100Rad, 即15000Rad)，以淋巴细胞∶肿瘤细胞＝(20～40)∶1加入，间隔5～7d刺激1次。IL-2(上海生物制品研究所)50U/ml，间隔3～4d追加1次。换液一般采取对半置换法。
细胞毒测定：采用51Cr释放法。收集靶细胞调整计数为2×106/ml，取0.5ml加Na51CrO4 (美国杜邦公司)2590kBq(70μCi)，37℃ CO2孵箱孵育3～3.5h。洗涤3次，调整细胞数为105/ml，96孔U型板中每孔加入100μl，设3个复孔。每孔加入100μl不同数量已洗除IL-2的效应细胞，设置不同的效靶比。最大释放孔加入100μl 1％TritonX-100，自然释放孔加100μl完全培养液。孵育4h。自每孔吸取上清100μl入计数管中。γ计数仪测定其cpm，计算特异性杀伤率（CI%），相同实验均重复2次。
单抗阻断实验：W6/32，抗HLA-A、B、C单抗；T8，抗CD8分子的单抗（本校免疫教研室提供）。按5μg/ml和效应细胞37℃ CO2孵箱孵育45min后，进行杀伤实验，求得抑制百分率。
淋巴细胞刺激增殖实验：淋巴细胞以0.5×105/孔入平底96孔板，加入经照射150Gy的刺激细胞，反应细胞∶刺激细胞＝20∶1，IL-2浓度50U/ml。CO2孵箱孵育3d后，每孔加入37kBq 3H-胸腺嘧啶20μl，共孵育后收集样品于玻璃纤维滤纸上，烤干后加入闪烁液，β液闪计数仪计数。对照组为单一淋巴细胞，并计算刺激指数。
流式细胞仪检测淋巴细胞表型：采用直接免疫荧光法。所用荧光单抗：（1）对照组，鼠抗人IgG1。（2）Leu-4(CD3)、Leu-3(CD4)、Leu-2(CD8)，均为IgG1 (Coulter Clone)。每组准备106个细胞，PBS洗涤2次，加入荧光标记抗体10μg(10μl)，室温下作用30min，流式细胞仪(Coulter Electronics)检测。
统计方法：采用t检验的方法对两组资料样本均数进行比较。
结果
1.MLTC初步筛选HLA-A匹配的淋巴细胞：共采集并分离获得9/11例次胃癌患者的PBL（编码为p1～9）及10/16例次健康人的PBL（编码为h1～10），用经检测或文献报道HLA-A、B、C已知的3种胃癌细胞系（见表1），照射后进行MLTC，IL-2浓度为50U/ml。大多数供者的PBL在MLTC中淋巴细胞呈逐渐减少趋势，至第5～9天完全死亡。有意义的是p5、p8及h4的淋巴细胞经MLTC，第4～6天出现明显的增殖趋势，细胞体积变大，并呈豆芽、泪滴状等。刺激细胞亦于3d后破碎死亡。在排除同种异体抗原激发T细胞增殖的同时，这3个供体中可能存在HLA-A表型与对应刺激细胞KATO-3、MKN45或SGC7901相匹配的供体〔3〕。
2.初筛的淋巴细胞HLA-A、B抗原的鉴定：对经MLTC初步筛选的候选淋巴细胞进行分型鉴定，测定结果如表2所示。
表1 胃癌细胞系HLA分子的表达
Table 1. Expression of HLA on surface of the gastric cancer cell lines
| Cancer cell | HLAⅠ | HLAⅡ | ||
| A | B | C | ||
| KATO-3* | 02，24 | 15，46 | - | - |
| MKN45* | 24 | - | - | - |
| SGC7901 | 28，31 | - | ND | ND |
| *: Results were cited from reference 12; -: no experession |
图1 经诱导h4淋巴细胞表型分析
Fig 1. Phenotype of induced h4 lymphocytes
表2 候选淋巴细胞HLAⅠ类分子的表达
Table 2. Expression of HLAⅠ on surface of the screened lymphocytes
| Donor | HLAⅠ | Stimulating cells | ||
| A | B | C | ||
| p5 | 02，24 | 17，44 | ND | KATO-3 |
| p8 | 01，13 | 13，57 | ND | SGC7901 |
| h4 | 02，24 | 22，62 | ND | KATO-3、MKN45 |
ND：not done 3.刺激增殖实验：选择经MKN45刺激的h4淋巴细胞为反应细胞，MKN45为刺激细胞，各组反应细胞3H-胸腺嘧啶掺入的cpm值及刺激指数SI见表3。
表3 h4淋巴细胞刺激增殖反应
Table 3. Proliferative response of h4 T lymphocytes induced by allogeneic gastric tumor cells
| Stimulator | HLA-A
antigens |
3 H-thymidine
incorporation(cpm) |
SI |
| RPMI 1640+IL-2 |
773±87 |
1.0 |
|
| MKN45 | 24 | 6531±555 | 8.4 |
| MKN45+IL-2* | 24 | 9095±1532 | 11.8 |
| MKN45+IL-2 | 24 | 31927±745 | 41.3 |
| KATO-3 | 02,24 | 3062±384 | 4.0 |
| KATO-3+IL-2 | 02,24 | 9287±330 | 12.0 |
| SGC7901+IL-2 | 28,31 | 1139±5 | 1.5 |
*: IL-2 20U/ml, Others IL-2 50U/ml 4.MLTC诱导胃癌相关的T淋巴细胞群：继续采用初筛时刺激细胞诱导相应淋巴细胞。诱导中，初次加入刺激细胞可见其在1h后即被淋巴细胞包围成团。随后几次刺激，可见刺激细胞溶解消失的时间逐渐缩短，以致最后一次刺激时，在倒置显微镜下取样并台盼蓝染色发现，刺激细胞在加入后4h即有(20～40)％的细胞溶解死亡，12h时可达到(80～90)％。诱导中淋巴细胞在增殖的同时，已活化细胞的死亡也日趋明显，此即出现了淋巴细胞增殖高峰期，后于第29～34天细胞数显著下降直至大部分死亡。详见表4。另外，在诱导中出现的死细胞聚集成团，培养液中残渣增多变浑，对细胞的生长有较大影响，及时用200目的筛网过滤、并低速离心可去除大部分死细胞。且发现淋巴细胞的生长对细胞密度的依赖性极高，一般以(1～2)×106/cm2密度接种传代为佳。
5.流式细胞仪检测淋巴细胞表型：对经MKN45刺激3次的h4淋巴细胞进行CD3、CD4、CD8表型分析，结果见图1。
6.胃癌相关T淋巴细胞的特异性杀伤作用：对KATO-3刺激获得的p5 PBL产生的胃癌相关T淋巴细胞命名为p5-CTL、MKN45和KATO-3分别诱导h4 PBL产生的胃癌相关T淋巴细胞命名为h4-CTL1、h4-CTL2。分别进行51Cr释放实验。
因KATO-3、MKN45均具有HLA-A24分子的表达，综合h4MKN-CTL、h4KATO-CTL对KATO-3、MKN45的杀伤率，以K562为对照组，求其平均值及标准差并进行t检验，其中3组数据与K562进行比较，虽然P＞0.05，但效应细胞对HLA-A匹配胃癌细胞的杀伤率已经表现出较高特异性的趋势。即使如此，仍然有2组数据P值分别小于0.05和0.002，由此初步说明，所诱导的T淋巴细胞对其刺激细胞及HLA-A匹配的胃癌细胞系的杀伤作用具有特异性，而并非NK细胞等其它效应细胞所致。
本研究进一步综合比较了p5-CTL对HLA-A匹配的KATO-3及非匹配的SGC7901杀伤率，结果如表6所示。t检验发现，结果类似于表5，在效靶比为1∶40时，T淋巴细胞对HLA-A匹配的KATO-3及非匹配的SGC7901杀伤率进行比较，差异具有显著性（P＜0.05）；效靶比1∶20时，虽然两者的杀伤率之间差别不显著，但已具有一定的差异趋势。由此进一步证实了所诱导的T淋巴细胞杀伤作用的特异性。
表4 MLTC诱导淋巴细胞增殖状况
Table 4. Proliferation of lymphocytes in MLTC
| Responder | Stimulator | Times of
stimulation |
Cell mumber
before stimulation (×105) |
Cell number
after stimulation (×107) |
Peak time of
proliferation (day) |
Inactive time
(day) |
Proliferative
multipules |
| p5 | KATO-3 | 4 |
5 |
1.0 | 23 | 33 |
20 |
| p8 | SGC7901 | 3 | 5 | 1.3 | 20 | 29 | 25 |
| h4 | KATO-3 | 4 | 5 | 5.0 | 21 | 32 | 100 |
| h4 | MKN45 | 4 | 4.5 | 3.0 | 24 | 34 | 89 |
表5 h4-CTL1、h4-CTL2对HLA-A匹配胃癌细胞及K562的杀伤率(%)
Table 5. Cytotoxicity (%) of h4-CTL1, h4-CTL2 against HLA-A matched gastric cancer cell and K562
| E/T ratio | KATO-3 | MKN45 | K562 |
| 1∶10 |
27±0.50 |
28±9.0 |
4±2.0 |
| 1∶20 | 31±6.9 | 32±4.0* | 4±0.8 |
| 1∶40 | 38±0.2** |
ND |
5±1.5 |
*: P＜0.05, **: P＜0.002 t test between gastric cancer cells and K562
表6 p5-CTL对HLA-A匹配的KATO-3及非匹配的SGC7901杀伤率(%)
Table 6. Cytotoxicity (%) of p5-CTL against HLA-A matched and un-matched gastric cancer cell and K562
| E/T ratio | KATO-3 | SGC7901 | K562 |
| 1∶20 |
30.5±8.6 |
7.7±0.7 |
4±0.7 |
| 1∶40 | 37.8±0.2*# | 14.2±5.2 | 5±0.4 |
*P＜0.05 t test between KATO-3 and K562
#P＜0.05 t test between KATO-3 and SGC7901 7.单抗阻断效应：在实施h4-CTL1、h4-CTL2 51Cr释放实验时，分别进行W6/32、T8单抗阻断实验，结果如图2所示(h4-CTL1杀伤效应的阻断作用未显示)。
从图中可以看出：h4-CTL2在效靶比为20∶1时，对KATO-3、MKN45杀伤率较高，W6/32对其杀伤的抑制率为74%，T8的抑制率为62%；对MKN45，W6/32的抑制率为46%，T8的抑制率为50%。
另外，实验中减少Na51CrO4的用量至2590kBq/106，增加其和靶细胞的孵育时间至3～3.5h，靶细胞51Cr的最大释放值可达1000cpm左右，而且最小释放值较低。
图2 h4-CTL2的杀伤效应及单抗阻断作用
Fig 2. Cytotoxicity of h4 KATO-CTL and inhibition of W6/32, T8 McAb
讨论
Crowley、Stevens等〔3，4〕用异体黑色素瘤细胞刺激患者的PBL，发现只要两者存在一个或一个以上HLA-A分子匹配，患者的T淋巴细胞即可增殖，并成功诱导黑色素瘤特异性的CTL。Saitoh等〔5〕在脑胶质瘤的研究中也观察到类似结果。鉴于预先测定HLAⅠ类分子耗时、昂贵，本研究通过异体MLTC，以PBL能否大量增殖（10倍以上）为标准初筛PBL供体后再进行HLA-A、B抗原的鉴定。通过此方法不但可以回避以上问题，而且对于因培养条件所限、PBL中CTLp过少等原因导致的无效刺激阶段可以直接予以终止。尤为重要的是一旦成功诱生T细胞的增殖，其实验中个体化的细胞诱生和培养方案可以直接指导后续MLTC。实验中初步筛选出3组反应细胞在相应胃癌细胞的刺激下发生明显增殖反应，鉴定其HLA-A、B抗原。发现1例健康人（h4）PBL的HLA-A（A2、A24）与KATO-3（A2、A24）、MKN45（A24）分别相匹配。1例患者（p5）的PBL的HLA-A（A2、A24）与KATO-3（A2、A24）的A抗原完全匹配。而且因为MKN45不表达HLA-B、C分子及HLAⅡ类分子，在不考虑A24等位基因差异的前提下〔5〕，可以说h4和p5的HLA分子与MKN45完全匹配。另1例患者PBL的A、B抗原则与刺激的SGC7901相差甚远，推测可能系异体抗原激发的CTL增殖。通过MLTC初筛HLA-A匹配的淋巴细胞是可行的。
一般认为，肿瘤特异性的CTL必须具备以下特性：（1）CTL来源于TIL或PBL。（2）在IL-2的作用下，用瘤细胞刺激4～6周后淋巴细胞可以扩增10～100倍。(3)这些效应细胞对自身肿瘤细胞或HLA-A匹配的瘤细胞系具有特异性杀伤作用，而不溶解K562、正常体细胞或其它组织类型的瘤细胞。（4）对靶细胞的溶解作用可以被抗MHCⅠ分子的单抗阻断。（5）效应细胞CD3+，可以是CD4+、CD8+ T细胞的混合，但多以CD8+的细胞占优势。本研究在低剂量IL-2的诱导下，对初筛获得的2份淋巴细胞继续用HLA-A匹配的异体胃癌细胞进行重复刺激，最终产生3组T淋巴细胞。通过表型鉴定、杀伤特异性实验、单抗的阻断作用，证实了它们基本均具备了肿瘤特异性CTL的一般特性。
胃癌患者及健康人的PBL中CTLp很少，要诱导产生肿瘤特异或相关的T淋巴细胞，本身就较用TIL诱导更为困难。近年来，随着培养条件的不断改进，尤其从健康人PBL中成功诱导肿瘤特异性CTL的实验层出不穷〔2〕。其诱导的成功与否，与IL-2的浓度、培养介质的要求、反应细胞与刺激细胞的比例和密度、刺激的周期等等。这就决定了诱导的成功与否存在一定机遇。譬如从h4的外周血6次分离PBL，只有1次诱导T淋巴细胞成功。
另外，亚洲人群中HLA-A2表型频率为45%，A24为25%，据此，以KATO-3、MKN45为刺激细胞，通过初筛MLTC的方法，依照Crowley发现的规律，应有较高的成功率，但实验结果并非如此，这除了与以上两个方面的原因有关外，还可能与刺激细胞和反应细胞的HLA-A表型相同但基因型不同有关。综上所述，要通过异体胃癌细胞系诱导产生肿瘤特异的或相关的T淋巴细胞，从理论和技术路线是可行的，但仍需进一步完善其最佳的培养条件，以增加成功的机率。
虽然经过3次刺激，T淋巴细胞的比例高达97.8％，且具有明显的胃癌杀伤特异性及MHC限制作用，但其中CD8＋细胞的比例相对较低，分析可能的原因：一方面归于刺激的次数太少，时间较短，从而未能产生绝对优势的CD8＋细胞。另外，诱导中是否产生了比例较高的具有杀伤效应的CD4＋T淋巴细胞，尚有待证实。
以异体HLA-A匹配的胃癌细胞系诱导产生胃癌特异性的CTL，是否对其它具有不同HLAⅠ类或Ⅱ类分子的细胞具有明显的排异反应，是一个至关重要的问题。Crowley、Stevens等也充分考虑了非匹配HLAⅠ类分子作为同种异体抗原激发CTL的增殖，通过多个异体黑色素瘤轮流刺激实验和对照杀伤实验，发现即使存在其它1个甚至3个位点的不匹配，此种排异性CTL的增殖并不明显，此种结果令人鼓舞，其产生的具体原因目前仍不甚明了〔3，4〕，在其它研究中也有类似的报道〔5，7〕，从本实验结果也证实了这一观点。首先，KATO-3、MKN45作为刺激细胞，无HLAⅡ类分子的表达〔10〕，而KATO-3的HLA-B抗原的不一致是产生排异性CTL的最可能的刺激分子，但从所诱导的T细胞群对HLA-A匹配胃癌细胞的特异性杀伤效应分析，此种可能的排异性CTL产生的效应不明显，加之在KATO-3、MKN45细胞表面CD80、CD86的共刺激作用下〔11〕，使得胃癌特异性CTL的诱生占据了主导作用。因此，在HLA-A分子匹配的前提下，排异性CTL增殖不明显的可能原因有：（1）绝大多数肿瘤细胞不表达或低表达具有强烈刺激作用的异体抗原HLAⅡ类分子。（2）HLA-A、B、C分子作为异体抗原其刺激作用本身就较HLAⅡ类分子弱，加之在于许多肿瘤细胞表面表达水平又较低，在不影响或不参与肿瘤抗原呈递事件的前提下，其作为异体抗原诱生排异性CTL的作用相应地即显得不甚明显。
基金项目：军队杰出人才基金资助项目
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(收稿日期：1998-11-09)