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Establishment of a method for detecting anti-HCV IgM using recombinated structural region antigens Wang Jian,Min Fuyuan,Zhang Shumin,et al.Beijing Youan Hospital 100054
Abstract Presence of IgM antibody to viral structurale protein can be taken as the marker of its rdplication,so the detection method for anti-HCV IgM was established using as HCV recombinated structural region antigens,including C,E1,E2,as the coated antigen and rabbit anti-human γ chain sera for neutralization and sheep anti-rabbit IgG coated for the sorbence of the complex of RAH-γ with human IgG.76 serum specimens of the hepatitis C patients were detected by indirect ELISA for anti-HCV IgM and by RT-PCR for RNA. The results suggested that IgM antibodies to C,E1,E2 were closely related with RNA (P＜0.005).The components of the IgM antibody,too were identified by indirect ELISA with recombinated antigens coated respectively.When whole-fragment C or C＋E2 were used as the coated antigens, anti-HCV IgM in 96.6% or 100% of serum specimens can be respectively detected.Using recombinated structurae region antigens,detection of anti-HCV IgM by ELISA was high sensitivity and specificity.
Key words: Hepatitis C virus IgM Polymerase chain reaction Antigen,viral
自Choo等首次成功克隆HCV部分基因片段以后，第一代、第二代抗-HCV IgG检测试剂盒相继问世，后者极大地提高了抗体阳性率和早期检出率。但由于IgG抗体在体内半衰期长，不能作为病情追踪观察指标。定性逆转录聚合酶链反应可检出血清中极少量病毒，可作为重要的病毒复制指标，而且其检测简便易行，因而我们曾致力于研究并建立了抗-HCV IgM检测方法，经大量临床标本检测确有其临床意义〔1〕。因目前对用非结构区多肽进行抗-HCV IgM检测特异性仍有疑异，我们选用了重组结构区抗原，对IgG处理方法作了大量改进，同时和RT-PCR检测结果进行了对比研究。
1 材料和方法
1.1 重组结构蛋白的来源 重组HCV结构区蛋白C，E1，E2源于中国药品生物制品检定所。
1.2 RT-PCR引物 购自仪诚公司。外引物：P1，5'-ACA CTC CAC CAT AGT TCA CTC- 3’(-320--300)；P2，5’-CAT GGT GCA CGG TCT ACG AGA- 3’(+3--18)。内引物：P3，5’-TGT GAG GAA CTA CTG TCT TCA- 3’(-296--276)；P4，5’-CTA TCA GGC AGT ACC ACA AGG-3'(-43--63)。HCV RT-nested PCR 按文献〔2〕法进行，PCR终产物长度为254bp。
1.3 抗血清制品 兔抗人γ链、羊抗兔IgG血清购自邦定生物医学公司，双扩效价均为1：32。HRP标记羊抗人IgM购自北京生物制品研究所。羊抗兔IgG化按文献〔3〕法进行。
1.4 血清来源及抗-HCV IgG检测 血清源于北京佑安医院住院急、慢性丙型肝炎病人。抗-HCV IgG经Abbott试剂盒检测阳性。
1.5 抗-HCV IgM检测
1.5.1 抗-HCV IgM(多肽抗原)检测 按文献〔1〕法进行。
1.5.2抗-HCV IgM(重组抗原)检测 包被和封闭：按常规将重组C，E1，E2区抗原混合后包被，使其终浓度分别为4μg/ml*3μg/ml和3μg/ml；单独包被各5μg/ml。常规方法封闭。血清IgG处理：羊抗兔IgG按常规方法包被，使终浓度为7.5μg/ml.在羊抗兔IgG包被板内加入180μl标本稀释液，加入1.5μl血清标本后混匀，将兔抗人γ链血清32倍稀释后再以1：96加入标本稀释液内，混匀后于37℃孵育1小时。
抗-HCV IgM测定：将上步处理液100μl移至抗原包被板孔内，4℃过夜；洗 板；加入1：1000稀释的HRP标记的羊抗人IgM，每孔100μl，37℃孵育1小时后洗 板，室温下OPD底物液显色10分钟，2mol/L H2SO4 50μl终止反应，测定492nm的吸光度A值(曾称光密度OD值)。求出S/N值以S/N≥2.1为阳性。
2 结果
RT-PCR的检测结果见图1。采用重组结构区抗原及新的血清IgG处理方法对9份阳性标本和1份阴性标本进行预试验，发现按32×96倍稀释兔抗人γ链血清较为合适，故用此浓度处理标本再进行检测，并与按文献〔1〕法检测结果相比较。其结果见表1。用两法对76份急慢性丙型肝炎病人血清进行抗-HCV IgM检测结果见表2。结果符合者42份，不符者34份，符合率为55.3%。经相关性χ2检验，P＞0.05，检测阳性率无显著性差异。
图 1 RT-nested PCR电泳结果
Fig.1 Electrophoresis map of RT-PCR products
8:pBR322/EcoRⅠ,BamHⅠ,StyⅠ,PvuIⅠ,PstⅠ,ScaⅠ.
1-7:RT-PCR products of the sera of patients
两法检测病人血清抗-HCV IgM结果与HCV RNA RT-PCR检测结果的比较见表3。前二者与后者符合率分别89.47%(68/76)和63.15%(48/76)，两符合率经U检验，P＜0.05，有显著性差异。重组抗原检测抗-HCV IgM结果与RT-PCR结果有很好的相关性
表 1 两种不同抗原及血清处理方法检测结果的比较(S／N)
Tab.1 Comparison of two neutralizing methods(S／N)
| 标本号(Sample No.) | ||||||||||
| A | B | C | D | E | F | G | H | I | J | |
| 重组抗原 新法处理
rHCVAg＋SAR-RAH-γ |
24.2 | 14.8 | 11.2 | 9.08 | 8.37 | 8.29 | 2.51 | 2.16 | 2.35 | 1.07 |
| 合成肽抗原鼠抗人γ链处理
Synthetic peptide antligens MAH-γ McAb |
20.9 | 10.3 | 8.85 | 7.45 | 6.26 | 6.07 | 2.28 | 2.32 | 2.13 | 1.11 |
(χ2检验，P＜0.005)。用重组C，E1，E2分别包被酶标板，用同法检测抗-HCV IgM，其抗体组成情况见表4。
表 2 两种抗-HCV IgM检测结果比较
Tab.2 Comparison of two methods in detection anti-HCV IgM
| Anti-HCV(C+NS3+NS4)IgM | 合计
Total | |||
| + | - | |||
| Anti-HCV(C+
E1+E2)IgM |
＋
－ |
37
13 |
21
5 |
58
18 |
| 合计
Total |
50 | 26 | 76 | |
表 3 抗-HCV IgM与RT-PCR结果比较
Tab.3 Comparison of RT-PCR and recombinant structure region antigens in detection of Anti-HCV IgM
| Anti-HCV IgM | ||||||
| C+E1+E2 | C+NS3+NS4 | 合计
Total | ||||
| + | - | + | - | |||
| RT-PCR | + | 52 | 2 | 38 | 16 | 54 |
| - | 6 | 16 | 12 | 10 | 22 | |
| 58 | 18 | 50 | 26 | 76 | ||
表 4 抗-HCV IgM抗体组成
Tab.4 Components of anti-HCV IgM
| 抗原Antigens | 例数
Cases |
合计
Total | |
| C | 56 | ||
| C(alone) | 15 | ||
| C，E1 | 11 | ||
| C，E2 | 8 | ||
| C，E1，E2 | 22 | ||
| E1 | 33 | ||
| E1(alone) | 0 | ||
| E1，C | 11 | ||
| E1，E2，C | 22 | ||
| E2 | 24 | ||
| E2(alone) | 2 | ||
| E2，C | 8 | ||
| E2，E1，C | 22 |
3 讨论
我们采用了不同区段重组结构区抗原，采取与以往不同的血清处理方法来检测抗-HCV IgM，发现用重组抗原表现出了较高的检出率和与HCV RNA RT-PCR检测结果的符合率，究其原因可能有下述几种：一是抗γ链单抗虽浓度较大，但可能由于反应位点少，不能形成较完全的空间位阻且仍游离于液相，故IgG仍能与抗原结合；而使用抗人γ链较之使用高浓度的抗人IgG〔4〕既能造成完全的位阻效应，又不与IgM抗体的κ／λ链作用从而削弱IgM反应强度，因而具有较好效果。包被羊抗兔IgG从理论上可吸附形成的抗体-抗抗体复合物，使抗HCV IgG进入固相表面，也有可能起到一定的作用。二是由于以前使用第二代试剂盒检测IgM抗体，抗原含C、NS3及HS4多肽片段；其C区抗原仅含少数抗原决定簇，由于含NS3及NS4故检测IgG尚可，但用于检测IgM则表现出C区暴露位点不足或亲合力小，出现重组抗原检测阳性者而原来试剂检测阴性；可能由于NS3或／和NS4的原因，与其它病毒等具交叉反应，造成重组C、E1、E2检测皆阴而使用多肽抗原检测阳性。但两者仍有相关性。本实验采用了纯粹的重组结构蛋白，其IgM抗体应为病毒本身直接刺激机体而产生，应更能反映了病毒的复制，用此抗原包被检测，其抗-HCV IgM与RT-PCR具有相关性。在58例IgM阳性血清中RT-PCR阳性占89.7%(52／58)。检测76例血清两者符合达率89.47%。
由于C区抗原为全片段，抗原位点多，暴露充分，加之含碱性氨基酸多，抗原性强，因而在刺激产生IgM抗体及其检测方面具有举足轻重的作用，单一C即可检出96.6%，再加上E2片段检出率可达100%。核心抗体高阳性率与乙肝相似。这两种IgM检测方法虽阳性率相近(58/76，50/76)，但符合率仅为55.3%(42/76)，故推测抗E1和E2的IgM抗体与抗NS3、NS4IgM具有不同意义。
我们首次采用丙型肝炎病毒C区及E1、E2区重组抗原混合包被和分别包被酶标板，用兔抗人γ链血清处理人血清标本，再用固相包被羊抗兔抗体吸附兔抗人γ链-人IgG复合物，建立了抗-HCV IgM检测方法。我们认为抗-HCV C IgM与病毒的复制有相关关系；采用重组C区全片段、C＋E2分别可检出96.6%、100%的抗HCV IgM，尤其是后者具有较高的敏感度和特异性。
参 考 文 献
1 闵福援，吴昊，王健，等.用ELISA法检测丙型肝炎病毒IgM抗体试剂盒的研制.中华实验和临床病毒学杂志，1994，8(2)：158-160.
2 Okamoto H,Okada S,Sugiyama Y,et al.Detection of hepatitis C virus RNA by a two-stage polymerase chain reaction with two pairs of primers deduced from the 5' -noncoding region.Japan J Exp Med,1990,60:215-222.
3 李成文编著.现代免疫化学技术.北京：军事医学科学院，1990，127-128.
4 Quiroga J A,Campillo M L,Catillo I,et al.IgM antibody to hepatitis. Hepatology ,1991,14:38-43