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抗CD4人-鼠嵌合抗体的鉴定及对PBMC增殖反应的影响
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 基础免疫学
作者：张智红 沈关心 杨敬 朱慧芬 张悦
单位：张智红（同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）；沈关心（同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）；杨敬（同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）；朱慧芬（同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）；张悦（同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）
关键词：人-鼠嵌合抗体；相对亲和力；增殖抑制效应
［摘 要］ 目的 对已构建表达的抗CD4人-鼠嵌合抗体的生物学特性进行鉴定，比较嵌合抗体与鼠源性单抗对抗CD3 McAb和EBV转化细胞诱导的外周血单个核细胞（PBMC）增殖反应的影响，以探讨抗CD4抗体的增殖抑制作用机制。方法 采用间接免疫荧光竞争抑制实验比较两种抗体对CD4抗原的相对亲和力，MTT法检测抗CD4抗体的增殖抑制作用。结果 转染瘤细胞具有稳定表达及分泌特异性抗CD4人-鼠嵌合抗体的能力；两种抗体对CD4抗原的相对亲和力相同；对经TCR途径刺激诱导的PBMC增殖反应均有抑制作用，嵌合抗体的增殖抑制作用较鼠源性单抗强。结论 抗CD4抗体的抑制作用很大程度上直接作用于TCR诱导的活化信号。
［中图分类号］ R392.11 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0265-03
Identification of anti-CD4 chimeric antibody and detection of its effects on PBMC proliferation
ZHANG Zhi-hong，SHEN Guan-xin，YANG Jing，ZHU Hui-fen，ZHANG Yue
（Department of Immunology，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China）
［Abstract］ Objective To explore the mechanism of the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on the peripheral blood mononuclear cells （PBMC） proliferation，we identified the biological characteristic of the anti-CD4 human／murine chimeric antibody，and compared their effects of the chimeric antibody with murine McAb on PBMC proliferation induced by anti-CD3 McAb or EBV transformed cell．Methods Using indirect immunofluorescence competed inhibiting experiment to compare two kinds of anti-CD4 antibodies on relative affinity，and to detect the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on PBMC proliferation with MTT test．Results Transfectoma has the ability to express and secrete specific anit-CD4 Human／murine chimeric antibody stably．Chimeric antibody has the same relative affinity as murine McAb．Both the anti-CD4 chimeric antibody and murine McAb could inhibit PBMC proliferation induced by TCR approach，and chimeric antibody has better inhibitory effects than murine McAb．Conclusion Most important inhibitory effects of the anti-CD4 antibody appeared to direct at TCR-induced activation signals．
［Key words］ Human／murine chimeric antibody； relative affinity； inhibitory effects on proliferation
CD4＋T细胞在免疫应答过程中起着重要作用［1］，抗CD4抗体可通过不同途径阻断CD4＋T细胞的功能，调控机体的免疫应答。抗CD4抗体在自身免疫性疾病治疗和抗移植排斥反应中具有极大的潜力［2，3］。目前国内抗CD4抗体均为鼠源性，用基因工程技术对鼠源性单抗进行改造，构建人-鼠嵌合抗体，既可保持鼠源性单抗的特异性，又降低了对人体的免疫原性。因此，将治疗性鼠源性单抗转变成人-鼠嵌合抗体具有很大的临床应用价值。为此我们对已构建表达的抗CD4人-鼠嵌合抗体的生物学特性进一步进行了鉴定，并比较嵌合抗体与鼠源性单抗对刺激原诱导的PBMC增殖抑制作用。
1 材料与方法
1.1 细胞株和细胞系 分泌鼠源性抗人CD4单克隆抗体（MCA3）及抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，均从ATCC公司引进；分泌抗人CD4人-鼠嵌合抗体D4.9的转染瘤细胞株由本室构建［4］；EBV转化的B细胞由本教研室吴雄文副教授课题组制备；T细胞淋巴瘤细胞系（CEM），由德国埃尔兰根大学临床免疫研究所引进。
1.2 主要试剂 MTT为Sigma产品；丝裂霉素C为Kgowa Hakko Kogyo Co，Ltd产品；FITC标记羊抗人IgG为上海生物制品研究所产品；鼠抗人κ链单克隆抗体为Sigma产品；羊抗人IgG、羊抗小鼠IgG、HRP标记羊抗小鼠IgG为华美公司产品。
1.3 腹水型抗体的制备及纯化［5］ 采用辛酸提取法对两种腹水型抗CD4抗体进行纯化，用U-200型紫外分光光度仪分别测其OD260和OD280值，根据公试计算IgG浓度［6］：
IgG浓度（mg／ml）＝（1．45×OD280－0.74×OD260）×稀释倍数
1.4 抗CD4人-鼠嵌合抗体的鉴定 采用交叉夹心ELISA法鉴定转染瘤细胞分泌抗体的Ig类型；以PBMC或CEM细胞为靶细胞，采用间接免疫荧光法鉴定抗体的特异性。
1.5 相对亲和力的测定 用间接免疫荧光法，经流式细胞仪计数检测CEM细胞表达CD4抗原的阳性率，分别检测纯化的抗CD4嵌合抗体或鼠源性单抗与CEM细胞结合的饱和抗体浓度。用间接免疫荧光竞争抑制实验检测抗CD4嵌合抗体和鼠源性单抗对CD4抗原的相互竞争抑制作用。
1.6 PBMC增殖实验 取一个单位健康人除红细胞的抗凝血（200 ml），通过密度梯度离心常规分离获得PBMC。96孔细胞培养板中每孔加入100 μl 2×106 ／ml PBMC悬液，然后分别加入不同浓度的抗CD4嵌合抗体或鼠源性单抗（终浓度为0.1、1、10、100 μg／ml），均设3复孔，设加入非特异性人IgG作为阴性对照，振荡混合后，置4 °C孵育1 h，分别加入抗CD3 McAb（杂交瘤细胞培养上清液）或丝裂霉素C（终浓度为25 μg／ml）处理后的EBV转化的B淋巴细胞（1×106 ／ml），置37 °C、5％ CO2培养箱中培养5 d。培养结束后每孔加10 μl MTT（5 mg／ml），继续培养4 h后，2 000 r／min离心5 min，去上清，每孔加入100 μl DMSO，振荡5 min后，用酶标仪测570 nm的OD值，记录结果。根据公式计算各实验组抗CD4抗体的增殖抑制率：
1.7 数据处理 各组实验数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 抗CD4嵌合抗体的特异性 ELISA试验表明，转染瘤细胞分泌的抗体能与抗人γ抗体和抗人κ轻链抗体反应，不与抗鼠γ抗体反应，从而证明此转染瘤细胞株分泌的抗体为含有人的γ恒定区和人κ轻链恒定区的抗体。采用间接免疫荧光法证明，转染瘤细胞分泌的抗体，与人PBMC反应的阳性率为35％～40％，与CEM细胞均呈阳性免疫荧光反应。其荧光强度与鼠源性CD4单抗相似，而与CD4抗原阴性的Raji细胞呈阴性反应。
2.2 抗体相对亲和力的测定 CEM细胞为CD4抗原表达阳性细胞，流式细胞仪检测证明阳性率为96.49％，纯化的抗CD4嵌合抗体和鼠源性抗CD4单抗与2×105 CEM细胞结合的饱和抗体浓度均为10 μg／ml。采用间接免疫荧光竞争抑制实验证明，当将抗CD4嵌合抗体以每毫升0、0.1、1、10和100 μg分别与2×105 CEM细胞作用后，鼠源性抗CD4单抗荧光染色细胞的荧光强度逐渐减弱，且荧光染色阳性细胞数也逐渐减少，分别为95.43％、89.93％、51.20％、17.87％、11.93％。当将鼠源性CD4单抗以每毫升0、0.1、1、10和100 μg分别与2×105 CEM细胞作用后，抗CD4人-鼠嵌合抗体荧光染色细胞的荧光强度逐渐减弱，且荧光染色阳性细胞数也逐渐减少，分别为96.49％、90.92％、49.98％、16.92％、6.54％。
2.3 抗CD4抗体的增殖抑制效应 抗CD4嵌合抗体或鼠源性单抗对抗CD3 McAb（见表1）或EBV转化的B细胞（见表2）诱导的PBMC增殖均有抑制作用。当抗CD4嵌合抗体浓度为0.1 μg／ml时对PBMC增殖已有抑制作用。当抗体浓度达10 μg／ml时，抑制作用明显增强。当继续增加抗体浓度时，未见抑制效应随着抗体浓度的增加而增强。表明当抗体浓度达10 μg／ml时即达最大抑制效应浓度。抗CD4嵌合抗体对几种刺激物诱导的增殖抑制作用明显强于鼠源性单抗。
表1 抗CD4嵌合抗体及鼠源性单抗对抗CD3 McAb诱导PBMC增殖反应的抑制作用
Tab 1 The inhibitory effects of the anti-CD4 chimeric antibody and murine McAb on anti-CD3 induced PBMC proliferation
| concentration of
antibody（μg／ml） |
chimeric antibody | murine McAb | ||
| n | n | |||
| 0 | 5 | 0 | 5 | 0 |
| 0.1 | 5 | 10.5±7．3* | 5 | 6．30±3．7 |
| 1．0 | 5 | 29．9±9．9* * | 5 | 10.3±6．7* |
| 10 | 5 | 52．0±13．8* * | 5 | 30.5±8．7* * |
| 100 | 5 | 58．0±10.7* * | 5 | 32．1±9．8* * |
*P＜0.05，* *P＜0.01，compared with control group
表2 抗CD4嵌合抗体及鼠源性单抗对单向混合淋巴细胞反应的抑制作用
Tab 2 The inhibitory effects of the anti-CD4 chimeric antibody and murine McAb on one-way mixed lymphocyte reaction（MLR）
| concentration of
antibody（μg／ml） |
chimeric antibody | murine McAb | ||
| n | n | |||
| 0 | 5 | 0 | 5 | 0 |
| 0.1 | 5 | 23．0±15．6* * | 5 | 12．1±9．80* |
| 1．0 | 5 | 48．4±13．2* * | 5 | 33．4±11．2* * |
| 10 | 5 | 65．5±14．3* * | 5 | 46．0±7．60* * |
| 100 | 5 | 66．4±12．6* * | 5 | 51．2±9．60* * |
*P＜0.05，* *P＜0.01，compared with control group3 讨论
通过基因工程技术，建立了稳定分泌抗CD4人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞［4］，且所保存的转染瘤细胞经多次冻存和复苏后仍具有稳定表达和分泌抗CD4人-鼠嵌合抗体的能力。相对亲和力测定结果表明，嵌合抗体能与鼠源性单抗竞争结合CD4分子。随着先加入嵌合抗体浓度的增加，能结合到CEM细胞表面的CD4嵌合抗体减少，故荧光阳性细胞亦随之减少。当固定检测抗体浓度，将竞争抗体稀释成不同浓度时，两种抗体不同稀释度的竞争抑制率基本相同。说明抗CD4 人-鼠嵌合抗体与鼠源性单抗对CD4抗原具有相同亲和力，且结合位点一致。在相对亲和力相同的情况下对嵌合抗体的生物学效应进行研究，为其在临床上的应用提供科学实验依据。
抗CD3 McAb是T细胞多克隆刺激剂［7］，在低浓度时能通过TCR途径刺激T细胞活化增殖。混合淋巴细胞培养实验通常使用同种PBMC或分离的T、B细胞作为刺激细胞，但这些细胞不易标准化。EBV转化的B细胞可高表达MHC-Ⅱ类分子和B7-1、B7-2［8］，因此具有较强的刺激效应T细胞增殖的能力，且易标准化，故本实验所用的同种细胞性抗原为EBV转化的B细胞。
抗CD3 McAb及同种异体细胞性抗原均是经TCR途径刺激诱导T细胞活化增殖的。本实验结果表明，抗CD4嵌合抗体和鼠源性单抗对由抗CD3 McAb及同种异体细胞性抗原诱导的PBMC增殖均有抑制作用，其增殖抑制效应是剂量依赖性的，在抗体浓度为10 μg／ml时达最大抑制效应。抗CD4抗体对IL-2诱导的PBMC增殖的抑制作用较弱［9］。提示，抗CD4抗体的抑制作用很大程度上直接作用于TCR诱导的活化信号，CD4分子的交联干扰了TCR刺激后组成的多功能传导复合体的形成。由于抗CD4抗体封闭了细胞表面CD4分子，使T细胞不能与MHC-Ⅱ类分子结合，从而使T细胞缺乏活化必需的信号而变成无能（anergy）［10］。抗CD4抗体对由IL-2诱导的增殖抑制作用较弱，而对由TCR途径刺激的PBMC增殖抑制作用较强，从而提示抗CD4抗体的抑制作用机制可能是：①阻断与MHC-Ⅱ类分子非多态区相互作用的位点；②从空间排列上阻止CD3和CD4的共聚集；③通过CD4分子介导T细胞传递阴性信号；④经CD4使P56lck募集到TCR复合物上，对于最有效的TCRζ链磷酸化和Zap70的活化很重要，Zap70的活化是导致T细胞增殖的关键环节，抗CD4抗体可能是通过阻止P56lck的募集使CD4与TCR复合体隔离开来，从而使T细胞不能被活化。
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（39370628）
［作者简介］ 张智红（1971－），女，湖北武汉市人，助理讲师，硕士，主要从事分子免疫学的研究，现在工作单位：华中理工大学生命科学与技术学院生物医学光子学研究所，武汉 430074。
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［收稿日期］ 1999-12-01；［修回日期］2000-04-17