Survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞株凋亡的实验研究

【摘要】  目的 探讨Survivin反义寡核苷酸对K562细胞株凋亡的影响。方法 将K562细胞分为四组：反义组、无义组、脂质体组及空白对照组，通过脂质体将Survivin反义寡核苷酸转染入各组K562细胞，用免疫组化法测定转染前后K562细胞Survivin基因及Caspase3的表达差异，用 Tunel及Annexin VFITC测定各组细胞的凋亡率。 结果 Survivin基因在K562细胞高表达，转染反义核苷酸后其表达下降，转染Survivin基因反义核苷酸后Caspase3的表达较其它各组升高，K562细胞生长受抑，细胞凋亡率升高。结论 Survivin反义寡核苷酸能够下调Survivin基因的表达，促进白血病细胞株K562的凋亡。

【关键词】  Survivin 反义寡核苷酸 K562细胞 凋亡 基因治疗

    Apoptosis of K562 cells induced by antisense oligonucleotide targeting Survivin

    LI Jianchang1  XU Youhua2  JIA Xiuhong1

    1 Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603；

    2 Department of Hematology,the Children's Hospital,Chongqing Medical University

    【Abstract】  Objective  To study the apoptosis of leukemia cells induced by antisense oligonucleotide targeting Survivin.Methods  Oligonucleotides were delivered in the form of complexes with Lipofectin. K562 cells were divided into four groups: ASON group,NSON group,lipofectin group,and control group. The expression of  Survivin Caspse3 was examined by immunohistochemistry(SABC). And detected the apoptotic rate of each group with two methods:  Tunel assay and Annexin VFITC assay.Results  The protein of Survivin is overexpress in K562 cells ,but after treated with antisense oligonucleotide, the level of expression was down regulation. After transfection, the expression of caspase3 of ASON group was upgrade contrast to other three groups（P＜0.05）.The apoptotic rates detected by Tunel assay and Annexin VFITC assay of ASON group were all higher than other three groups（P＜0.05）.Conclusion  Antisense oligonucleotide targeting Survivin can down regulate the protein expression of Survivin, and can induce K562 cells to apoptosis.

    【Key  words】  Survivin,antisense oligonucleotide,  K562 cells,  apoptosis,  gene therapy

    Survivin是1997年发现的一种新的凋亡抑制基因，属凋亡抑制蛋白家族（IAPs），定位于17q25上，广泛地表达于胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞，在正常分化成熟组织中未见表达［1］。Survivin基因在胚胎发育及肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用。研究表明，用反义技术下调Survivin基因的表达，能明显抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，并促进化疗药物的敏感性［2］。我们以脂质体作为载体［3］，将Survivin反义寡核苷酸导入白血病细胞株K562，用多种方法检测其凋亡指数，观察Survivin反义寡核苷酸诱导凋亡的作用。

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂  脂质体（Lipofectamine TM）购自美国Invitrogen公司，Survivin山羊抗人多克隆抗体及Caspase3鼠抗人单克隆抗体均由美国Santa Cruz公司提供，Tunel原位凋亡试剂盒由德国Roche公司提供，Annexin VFITC凋亡检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。

    1.2  寡核苷酸  Survivin反义寡核苷酸（5'CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3'）及无义寡核苷酸（5'GCCATGGCTACCTTAGCGTT3'）均由上海生物工程技术服务有限公司合成，两端各5个碱基硫代磷酸化修饰。

    1.3  细胞培养  白血病细胞株K562由重庆医科大学附属儿童医院外科研究室保存，DMEM F12细胞培养基及胎牛血清均购自Hyclone 公司。K562细胞置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。

    1.4  实验分组  分4组，反义寡核苷酸组（反义组）：反义寡核苷酸＋脂质体＋转染液；无义寡核苷酸组（无义组）：无义寡核苷酸＋脂质体＋转染液；脂质体组：脂质体＋转染液；空白组对照组（空白组）：等体积的转染液。

    1.5  转染  取对数生长期的细胞，用不含抗生素及血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，接种细胞悬液至6孔板，细胞数为3×105/孔，反义组及无义组加入寡核苷酸与脂质体稀释后的混合液中，反义寡核苷酸终浓度为0.555 nmol/ml，无义寡核苷酸终浓度为0.544 nmol/ml；脂质体组只加入相同剂量的脂质体；空白组只加入同体积的培养液，置37℃ CO2孵箱中培养6 h，培养之后，在不去除转染培养液的情况下，每孔加胎牛血清，使血清终浓度为10％，放入CO2孵箱中继续培养。

    1.6  免疫组化法测定转染前后Survivin基因及Caspase3的表达  分别将转染后的4组细胞吹打离心，制成单细胞悬液，均匀涂在玻片中心，室温下凉干。冷丙酮室温下固定15 min，3%H2O2溶液中室温下浸泡30 min，以充分灭活内源性过氧化物酶； 滴加封闭血清，置室温下20 min，甩去多余液体； 滴加相应一抗20 μl，4℃过夜；加生物素化二抗20 μl，37℃ 20 min，滴加SABC试剂，37℃ 20 min，PBS冲洗， DAB显色，显微镜下观察。同时PBS代替一抗做阴性对照。

    阳性结果判断（采用染色强度及阳性细胞数进行评分）：染色强度分四级：阴性(0分)、淡黄色(1分)、黄色(2分)、棕黄色(3分)；阳性细胞数分五级：＜5%(0分)、6%～25%(1分)、26%～50%(2分)、50%～75%(3分)、＞75%(4分)；随机计数5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞率。两者的乘积作为最终的结果判断：0分（－）、1～4分（+）、5～8分（++）、9～12分（+++），评分越高说明阳性程度越高。

    1.7  Tunel法检测细胞凋亡率［4］  将4组细胞制备单细胞悬液，涂片，4%的多聚甲醛（用0.01 M PBS配制）在15～25℃条件下固定60 min，用含3%H2O2的甲醇溶液孵育10 min，在冰上（2～8℃）用透化液（含0.1% Triton X100 的0.1%枸橼酸钠溶液）透化处理2 min，每份标本加20 μl的Tunel反应混合液（酶溶液与标记液以1∶9混合），37℃避光孵育60 min，每份标本加20 μl CoverterPOD，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加显色剂显色。

    1.8  Annexin VFITC检测法［4］  用去离子水按1∶4稀释结合缓冲液（4 ml结合缓冲液 + 12 ml去离子水）；0.01M PBS充分洗细胞，每组取总数约1×105细胞待测；用250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞；取195 μl细胞悬液加入5 μl Annexin VFITC；混匀后室温下避光孵育10 min；取190 μl结合缓冲液洗细胞1次；用190 μl结合缓冲液重新悬浮细胞；加入10 μl 20 μg/ml的碘化丙锭溶液（终浓度为1 μg/ml）；上流式细胞仪检测分析。

    1.9  统计学处理  数据用SPSS11.0统计软件进行分析，以P＜0.05为显著性标准。Tunel及Annexin VFITC检测的细胞凋亡率以x±s表示，Survivin及Caspase3阳性表达强度的变化采用秩和检验（KruskalWallis TEST）进行分析。

    2  结果

    2.1  转染前后K562细胞survivin基因的表达  Survivin蛋白表达在K562细胞的胞浆或（和）胞核，阳性细胞可见胞浆或（和）胞核被染成黄色或棕黄色。K562细胞中Survivin蛋白呈高表达。转染反义寡核苷酸后K562细胞的Survivin 表达下降，而其他三组未见明显变化。结合染色强度进行综合评价（见表1）。表1  Survivin蛋白表达检测结果组别注：反义组48 h与其他三组比较P＜0.05，n=20

    2.2  转染前后K562细胞Caspase3的表达  显微镜下观察，Caspase3阳性细胞的胞浆被染成棕黄色，反义组24 h Caspase3的阳性程度明显高于其他三组，与其它三组间两两比较均有统计学意义（P＜0.05），无义组、脂质体组、空白组之间两两比较均无统计学意义（P＞0.05）。转染48 h后，反义组Caspase3表达强度继续升高，与其它三组间两两比较均有统计学意义（P＜0.05），与反义组24 h比较P＜0.05，有统计学意义（见表2）。表2  Caspase3蛋白表达检测结果组别注：反义组与其他三组比较P＜0.05，n=20

    2.3  Tunel实验结果  显微镜下观察，Tunel阳性细胞的胞核被染成棕黄色，反义组24、48 h Tunel的阳性率为22％、32％，均明显高于同时间其他三组，与其它各组间两两比较均有统计学意义（P＜0.05），反义组48 h比24 h阳性率升高（P＜0.05），有统计学意义。无义组、脂质体组、空白组之间两两比较P＞0.05，无统计学意义（见表3）。 表3  Tunel检测结果组别  注：反义组与其他三组比较P＜0.05，n=5

     2.4  Annexin VFITC检测结果  经流式细胞仪检测，反义组24 h K562细胞的凋亡率为19.80%，明显高于其他各组，与其它各组间比较均有统计学意义（P＜0.05），无义组、脂质体组、空白对照组之间两两比较P＞0.05，均无统计学意义，见表4。表4  流式细胞仪检测结果组别 注：反义组与其他三组比较P＜0.05，n=3

    3  讨论

    肿瘤不仅存在细胞增生过度，还有细胞凋亡过低，是一种细胞增生和凋亡平衡失调的综合性结果［5］。若细胞凋亡受阻就可使细胞永生化而恶变，凋亡受阻在白血病的发生发展过程中起着极其重要的作用。经检测发现白血病细胞均不同程度的存在抗凋亡基因的高表达。

    Survivin属凋亡抑制蛋白家族（IAPs），Survivin蛋白以细胞周期依赖特异性表达于G2/M期，参与有丝分裂过程中纺锤体的形成，保持有丝分裂的真实性，从而使细胞顺利通过G2/M期［6］。Survivin基因在胚胎发育及肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用。对IAPs凋亡抑制作用的机制研究表明，IAPs主要通过抑制半胱天冬蛋白酶(Caspase)家族成员介导的蛋白酶级联反应过程中位于下游的效应Caspase活性发挥作用。Survivin是肿瘤基因治疗的理想靶点［7］。Survivin可部分抑制Bax和Fas诱导的细胞死亡，保护细胞免受procaspase3、procaspase7过表达诱导的凋亡，抑制这些酶原活化的进程；还可以诱导肿瘤坏死因子受体介导的NFκ活化，从而发挥其抗凋亡作用［8］。Survivin抗凋亡机制较复杂，目前尚不完全清楚，有待进一步研究。

    通过反义技术来封闭凋亡抑制基因的表达是肿瘤治疗的新思路、新策略。O1ie等针对Survivin mRNA设计出6条反义寡核苷酸，然后应用荧光定量PCR筛选到下调mRNA作用最强的ASODN4003。用此序列的反义寡核苷酸作用于肺癌细胞系，用实时定量PCR法检测发现， 转染20 h后Survivin mRNA含量下降70％［2］。

    本研究中采用此序列，通过阳离子脂质体介导的方式转染入K562细胞。经检测发现，Survivin基因在白血病细胞株K562中呈高表达。将Survivin反义寡核苷酸转染K562细胞后，24 h后K562细胞的Survivin蛋白表达开始出现下降趋势，48 h后Survivin蛋白表达明显下降，这说明反义寡核苷酸能够部分阻断Survivin基因的表达，为以Survivin反义寡核苷酸治疗白血病提供了可能。

    半胱天冬蛋白酶（Caspase）家族在介导细胞凋亡的过程中起着极其重要的作用，其中Caspase3处于各种凋亡传导途径的共同下游，它在细胞凋亡过程中发挥重要作用，是凋亡的关键执行分子。本实验研究发现，Survivin反义寡核苷酸转染K562细胞后Caspase3蛋白表达升高，这表明Survivin基因在K562细胞中，对Caspase3的表达起着抑制作用。由此，我们考虑Survivin反义寡核苷酸之所以能够促进K562细胞凋亡可能与上调Caspase3的表达有关。

    Tunel及Annexin VFITC 均是检测细胞凋亡的常用方法。我们运用这两种方法检测发现，转染Survivin反义寡核苷酸后K562细胞凋亡率较其他对照组细胞凋亡明显增加，这说明Survivin反义寡核苷酸能够促进K562细胞凋亡，对白血病细胞有一定的作用。

【参考文献】
  ［1］ Ambrosini G, Adida C,Altieri DC.A novel antiapoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma［J］. Nat Med,1997,3(8):917921.

［2］ Olie RA, SimoesWust AP, Baumann B,et al.A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy［J］. Cancer Res, 2000,60(11):28052809.

［3］ Kawaura C,Noguchi A,Furuno T,et al.Atomic fore microscopy for studying gene transfection mediated by cationic liposomes and with a cationic cholesterol derivative［J］. Febs Lett,1999,421(1):6972.

［4］ 沈关心，周汝麟.现代免疫学实验技术［M］.第2版.武汉：湖北科学技术出版社，2002:213223.

［5］ 吴其夏，余应年，卢建，等.病理生理学［M］. 北京：中国协和医科大学出版社，2003: 99109.

［6］ Suzuki A，Shiraki K．Tumor cell dead or alive：caspase and survivin regudate cell death，cell cycle and cell survival［J］．Histol Histopathol，2001，16(4)：583593.

［7］ Alteri DC，Marchisio PC，Marchisio C．Survivin apoptosis：an interloper between cell death and cell proliferation in cancer［J］．Lab invest，1999，79(11)：13271333.

［8］ Deveraux QL，Reed JC. IAP family proteinsuppressors of apoptosis［J］.Genes Dev,1999,13(3):239252.

作者单位：1 滨州医学院附属医院儿科 滨州市 256603；2 重庆医科大学附属儿童医院血液科