点击显示 收起
摘要:目的 探讨硒对氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导体外培养牛主动脉内皮细胞Caspase-3酶的影响。 方法 Ox-LDL与硒处理牛主动脉内皮细胞后，通过流式细胞仪、DNA电泳检测凋亡细胞，测定Caspase-3酶活性。 结果 Ox-LDL作用内皮细胞后，细胞凋亡DNA电泳呈梯度条带;加入硒干预后，内皮细胞平均凋亡率及Caspase-3酶活性吸光度比值较Ox-LDL组明显降低（P<0.05）。 结论 硒能减少Ox-LDL诱导体外培养的牛主动脉内皮细胞凋亡，部分通过抑制Caspase-3酶活性而发挥抗凋亡的细胞保护效应。
关键词:氧化型低密度脂蛋白;硒;凋亡;Caspase-3
Impact of selenium on the apoptosis induced by oxidized low-density lipoprotein in cultured bovine aortic endothelial cells.CHEN Shi-xiong，CHEN Sheng.（Danzhou Municipal Land Reclamation Hospital，Danzhou571700，Hainan，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate the effects of antioxidant selenium on the oxLDL-induced apoptosis of bovine aortic en-dothelial cells（BAECs）and relevant mechanism. Methods BAECs were isolated and cultured.The endothelial cells were cultured with selenium for12hours and then were treated with oxLDL for24hours.The apoptosis of the endothelial cells was checked by the flow cytometry and DNA electrophoresis，while caspase-3activity was measured simultaneously. Results The DNA electrophore-sis showed typical ladders.While the endothelial cells cultured with selenium，the mean of apoptotic rates and caspase-3enzyme ac-tivity significantly decreased（P<0.05）. Conclusion Selenium can reduced the apoptosis of cultured endothelial cells induced by oxLDL.This effect may be mediated by significantly suppressing caspase-3activity.
Key words:OxLDL;Selenium;Apoptosis;Caspase-3
内皮损伤在动脉粥样硬化、高血压、急性冠脉综合症等事件的发生发展中起着重要作用。研究表明Ox-LDL可诱导内皮细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡中的重要效应蛋白酶，在凋亡通路上产生终末效应事件。硒作为人体必需微量元素，已报道具有抗氧化和增强机体免疫力等功能。本研究旨在观察硒对Ox-LDL诱导体外牛主动脉内皮细胞的Caspase-3酶的影响，探讨其对内皮细胞的保护效应，为防治心脑血管病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（Trypsin）等购自GIBCO公司;亚硒酸钠（Se）、人von Willebrand因子（Ⅷ因子-相关抗原）、其他试剂均为国产分析纯试剂。caspase-3活性检测试剂盒购自R&D公司。
1.2 实验方法
1.2.1 Ox-LDL的制备与鉴定 采用两步超速离心法分离人血浆LDL。测定所得脂蛋白样品的蛋白质含量。LDL溶于磷酸缓冲液PBS（400mg/L），加入灭菌CuSO 4 溶液（终浓度为10μmol/L），37℃温育24h。
用前加入终浓度为10μmol/L EDTA终止反应。制备的Ox-LDL经2g/L琼脂糖凝胶电泳，苏丹黑B染色后观察迁移率以验证氧化修饰程度。
1.2.2 细胞分离、培养 无菌条件下取新生小牛主动脉15cm，胰酶消化法分离出原代内皮细胞，加入DMEM培养液制成细胞悬液，接种于培养瓶中置于37℃、5%CO 2 培养箱中，0.05%胰蛋白酶和0.02%ED-TA消化传代。将传代的内皮细胞分别接种于6孔板，加入DMEM培养液，置于培养箱中，待细胞生长至融合状态后以无血清的DMEM培养液静置24h，即按实验要求分组处理。
1.2.3 实验分组 ①对照组;②Ox-LDL组:给予Ox-LDL（100μg/L）作用内皮细胞24h;③Se组:以Se（3mmol/L）预处理内皮细胞12h，然后给予Ox-LDL（100μg/L）作用24h;分别检测相关指标（Caspase-3的活性在作用18h后检测）。
1.2.4 流式细胞仪检测（FCM） 分孔收集细胞（5×10 5 ），离心（1200r/min）3min弃上清，沉淀中加入1ml PBS溶液混匀，离心（1200r/min），再弃上清液。加入1ml的Annexin-V-FITC和PI室温下避光15min，上机检测。Annexin-V-FITC将凋亡细胞标记上荧光（FITC呈绿色），PI则为红色荧光。因此，将细胞用两种染料同时染色后，可以检测出非凋亡的活细胞（FITC - /PI - ）、凋亡细胞（FITC + /PI - ）及坏死细胞（FITC + /PI + ），计算凋亡细胞比率。
1.2.5 DNA电泳 酶消化法分瓶收集细胞（1×10 6 ）。加入500μl细胞裂解液，65℃温浴过夜。酚/氯仿抽提两次，离心去上清液，获得细胞总DNA，加入0.1mg/ml RnaseA作用1h，将样本置于-20℃保存。取DNA提取物加入加样孔，在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带。
1.2.6 Caspase-3酶活性测定 分组收集细胞（2×10 6 ）。用冰预冷的PBS洗1次后，加入caspase-3裂解液，冰育10min后，4℃离心（12000r/min×10min），取上清液。用考马斯亮蓝法（Bradford法）检测上清液中的蛋白质浓度。按试剂盒说明书要求将反应底物DEVD-p-nitroanilide（p-NA）加入细胞裂解上清液中，激活的caspase-3剪切caspase特异性的多肽DE-VD，释放出显色分子p-NA，用酶标仪在405nm波长检测吸光度，则反映上清液中的caspase-3活性，以各实验组的吸光度与对照组细胞的吸光度之比值表示（OD ratio）。
1.3 统计学方法 所有实验数据采用均数x±s标准差表示;两组间比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 DNA电泳分析 图1（略）结果示各组内皮细胞经Ox-LDL（100μg/L）处理24h后，DNA电泳可见明显梯型条带，未经Ox-LDL处理的对照组则无梯型条带;其中Se组条带较弱，间接提示Se可抑制Ox-LDL诱导的凋亡作用。
2.2 各组内皮细胞平均凋亡率比较 流式细胞仪检测结果显示，预先12h加入Se（3mmol/L），然后给予Ox-LDL（100μg/L）刺激内皮细胞，Ox-LDL组的细胞平均凋亡率较对照组明显增加（P<0.05）;Se组的细胞平均凋亡率较Ox-LDL组明显降低（P<0.05）。
2.3 各组内皮细胞Caspase-3酶活性比较 预先12h加入Se，然后给予Ox-LDL刺激内皮细胞，结果发现Ox-LDL组的Caspase-3酶活性较对照组明显增加（P<0.05），Se组的Caspase-3酶活性较Ox-LDL组明显降低（P<0.05）。
3 讨论
本实验应用Ox-LDL刺激内皮细胞24h以后，应用流式细胞仪观察到亚二倍体峰的形成且在G1期前出现，DNA电泳检测到特征性梯度条带，均证明凋亡的存在。加入硒干预后，硒组内皮细胞的平均凋亡率和Caspase-3酶活性吸光度比值分别较Ox-LDL组减少（P<0.05）。
细胞凋亡是一个由Casepase蛋白激酶介导的蛋白酶级联反应，这一过程中有多种促调亡的蛋白酶和抗调亡的蛋白酶起着相互抗衡的作用，两者失调导致细胞调亡发生 ［1］ 。caspase-3则是一种重要的蛋白水解酶，在凋亡过程中起着核心作用 ［2］ 。硒是人和动物的必需微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx）和硒蛋白P的重要成分，参与清除体内的过氧化氢和有机过氧化物，防止产生自由基;体内GPx、PHGPx等抗氧化酶亦可直接拮抗自由基的毒性作用。研究表明硒的抗氧化作用，不仅在于维持细胞膜脂的固有自然状态，也表现在防御膜脂质过氧化损伤的作用 ［3］ 。体外实验表明，硒可通过氧化还原作用抑制Caspase-3酶活性，阻止细胞发生凋亡或坏死，还可通过抑制ASK1/JNK的作用而上调bcl-2的表达，抑制Caspase-3的激活来促进细胞增殖;另一方面通过PI3-Akt途径，阻止凋亡发生。两者都抑制Caspase3、Caspase-9的激活 ［4］ 。另一组实验证明硒可通过抑制ASK1的激活和P 38 MAPK信号传导途径而阻止NO诱导的凋亡级联反应 ［5］ 。本实验结果表明，硒能减少Ox-LDL诱导体外培养的牛主动脉内皮细胞凋亡，部分通过抑制Caspase-3的激活而发挥抗凋亡的细胞保护效应。
参考文献:
［1］Berk BC，Abe JI，Min W，et al.Endothelial atheroprotective and anti-in-
flammatory mechanisms［J］.Ann N Y Acad Sci2001;947:93～109.
［2］ Oxidized LDL triggers phosphatidylerine exposure in human monocyte cell lines by both caspase-dependent and-independent mechanisms［J］.FEBE Lett.2004;578（1）:169～174
［3］ Lijiang Shen，Alex Sevanian.OxLDL induces macrophage-GCS-HS protern expression:a role for OxLDL-associated lipid hydroperoxide in GSH Synthesis［J］.Lipid Research.2001;42:813～823.
［4］Yoon SO，KimMM，Park SJ，et al.Selenite suppresses hydrogen peroxide
-induced cell apoptosis through inhibition of ASK1/JNK and activation of PI3-K/Akt pathways［J］.Faseb J.2002;16（1）111～114.
［5］Zaisen W，Cheng J.Antimitogenic and proapoptotic activities of methylse-lenic acid in vascular endothelial cells and associated effects on PI3K-AKT，ERK，JNK and p38MAPK signaling［J］.Cancer Research.2001;61:7174～7178.
作者单位:儋州市农垦医院内二科，海南儋州 571700.
作者简介:陈世雄（1972～），男，广东人，主治医师，主要从事心血管研究.
收稿日期:2005-03-01