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【摘要】 目的 建立CD4+T淋巴细胞胞内细胞因子染色法，研究艾滋病人在治疗过程中Th1/Th2平衡漂移。 方法 胞外CD分子染色和胞内细胞因子染色相结合，应用流式细胞术分析CD4+T淋巴细胞的Th1/Th2亚群百分比。 结果 艾滋病人Th1型细胞百分比的均值在治疗过程中呈阶梯状上升趋势， 其与治疗时间在68周内的回归系数为0.741，但无统计学意义（r=0.741,P=0.057）；Th2细胞百分比的均值在治疗过程中呈明显的下降趋势，其与治疗时间在68周内的回归系数为0.847，有统计学意义（r=0.847,P=0.016）。 结论 细胞内细胞因子染色能监测CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群漂移，对了解艾滋病人治疗效果有重要价值。
【关键词】 艾滋病 胞内Th1/Th2亚群 流式细胞术 细胞因子
Applying intracellular cytokine staining for analysis of CD4+ T cell Th1/Th2 balance shift in AIDS patients.
WANG Xiao-hui, FENG Tie-jian, SHI Xiang-dong, et al.
(Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518120, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To develop an intracellular cytokine staining method and investigate CD4+ T cell Th1/Th2 balance shift in AIDS patients. Methods CD molecules staining and intracellular cytokine staining were used synchronously. Flow cytometer was used to analyze the percent of CD4+ T cell Th1/Th2 subsets. Results During treatment of AIDS patients, the average percent of Th1 cell rised gradually and the average percent of Th2 cell percent descended obviously. There no significant differences between the percent of Th1 cell and therapy time of 68 weeks were observed（r=0.741, P=0.057）. While significant difference between the percent of Th2 cell and therapy time of 68 weeks was observed （r=0.847, P=0.016）. Conclusion Intracellular cytokine staining method is an excellent technological platform in monitoring Th1/Th2 balance shift and the the monitoring of Th1/Th2 balance shift is valuable for understand the effect of treatmetn of AIDS patients.
Key words：AIDS; Intracellular Th1/Th2; Flow Cytometry; Cytokine
艾滋病毒携带者在疾病进展过程中不但细胞亚群计数和细胞比值出现显著性改变，细胞功能也受到损伤，CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群漂移是CD4+T淋巴细胞功能改变的一种表现。传统的Th1/Th2亚群检测采用酶联免疫法（ELISA），通过测定血浆中Th1/Th2相关细胞因子的浓度来判断结果［1～3］，由于不同的细胞亚群可以分泌同一种细胞因子，传统方法所得结果为血液中全部细胞亚群分泌的细胞因子总值，不能区分单个细胞亚群细胞因子分泌情况。随着流式细胞术的发展，应用胞外CD分子染色和胞内细胞因子染色相结合的技术，可以将精确地将CD4+T淋巴细胞分为Th1亚群和Th2亚群［4］，这为我们分析艾滋病人的免疫状态提供了一种更好的手段。我们应用胞外CD分子染色和胞内细胞因子染色相结合的技术对艾滋病人在治疗过程中CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群漂移进行了检测和分析，现将研究方法和初步结果报告如下。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象 10例进行高效抗逆转录病毒治疗（HAART）的艾滋病人，从治疗开始连续跟踪68周，在各个观察时间点采集肝素钠抗凝血，样本在2h内进行刺激培养。
1.2 试剂准备 Fast Immune CD3-PerCP、CD8-APC、IFN-γ FITC/IL-4 PE、CD69-PE、Mouse γ2a PE/γ1 FITC、FACS Perm2溶液、Fast Immune EDTA溶液，上述试剂均购自BD公司。洗涤液（0.5%BSA，0.1% NaN3 PBS）和悬浮液（1%多聚甲醛，0.1% NaN3 PBS）均为自配。将佛波脂（PMA）粉剂1mg以10ml DMSO溶解后，再用无菌PBS 按1:10连续稀释2次；分装成10μl小管-20℃冻存，使用前加入无菌PBS 990μl稀释成工作液（10ng/ml）；将依诺霉素（Ionomycin）1mg以10ml DMSO溶解后，再用无菌PBS 按1:10稀释，分装成10μl小管-20℃冻存，使用前加入无菌PBS 90μl稀释成工作液（1μg /ml）；将布雷菲德菌素A (Brefeldin A，BFA)贮存液分装成10μl小管-20℃冻存，使用前加入无菌PBS 90μl稀释成工作液（10μg/ml）。上述三种试剂均购自Sigma公司。
1.3 细胞孵育与刺激活化 在500μl全血中加入PMA工作液5μl、Ionomycin工作液10μl、BFA工作液10μl，将盖子拧紧，37℃水浴箱中孵育4h。
1.4 细胞洗脱 刺激管加50μl EDTA溶液，剧烈摇动后室温放置15min，再剧烈混匀10秒以洗脱贴壁的细胞。
1.5 溶血及细胞膜上打孔 100μl刺激血+1ml 1X FACS 溶血剂，轻轻摇动后，室温孵育10min。每支管加入2ml洗涤液，800rpm离心5min。去上清液，每管加500μl 1XFACS perm2打孔剂，混匀细胞后，室温孵育10min。每支管加入2ml 洗涤液，800rpm离心5min，去上清液。
1.6 荧光标记 刺激效果对照管中加入CD69-FITC、CD3-PerCP、CD8-APC各20μl；同型对照管中加入CD3-PerCP、CD8-APC、 Mouse γ2a PE/γ1 FITC各20μl；样本管中加入CD3-PerCP、CD8-APC、IFN-γ FITC/IL-4 PE各20μl。室温避光保存，孵育30min。
1.7 洗涤与悬浮 加2ml的洗涤液，800rpm离心5min。去上清，加300μl悬浮液，混匀后上机检测。
1.8 设门与检测 以CD3-PerCP和SSC设定T淋巴细胞亚群为G1，以CD8-APC反向设门，设定CD4+T淋巴细胞亚群为G2。样本管获取时，设置逻辑门G3=G1+G2,以IFN-γ FITC+/CD4双阳性T淋巴细胞群为Th1亚群,以IL-4 PE+/CD4双阳性T淋巴细胞群为Th2亚群，得各亚群百分比值。
1.9 统计分析 应用SPSS11.0 对Th1/Th2细胞亚群百分比值与治疗时间的关系进行回归分析。
2 结果
2.1 CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群检测主要流式图像和结果判读 采用四色荧光分析，先用两种荧光标记CD分子的单克隆抗体将CD4+T淋巴细胞区分出来，再用两种荧光标记细胞因子的单克隆抗体将分泌IFN-γ的Th1细胞亚群和分泌IL-4的Th2细胞亚群区分出来。图1表示通过CD3-PerCP设门将T淋巴细胞区分出来。图2表示通过CD3-PerCP和CD8APC的反向设门，将CD4+T淋巴细胞从淋巴细胞中区分出来。图3表示的是应用CD3-PerCP/CD8-APC/CD69-PE荧光染料组合检测淋巴细胞刺激活化率，右上象限的细胞群为刺激活化的CD4+T淋巴细胞。只有细胞活化率在90%以上，才能进行下一步实验。图4为同型对照，应用荧光标记鼠单克隆抗体检测非特异性荧光标记细胞的比率。图5中IFN-FITC阳性细胞为Th1细胞亚群，在右下象限；IL-4阳性细胞为Th2细胞亚群，在左上象限。图5得到的各细胞亚群百分比率需减去同型对照中相应象限的细胞百分比率作为最后结果。
图1 设定T淋巴细胞群为G1（略）
图2 设定CD4+T细胞亚群为G2（略）
图3 T淋巴细胞激活率分析（略）
图4 同型对照（略）
图5 Th1/Th2细胞亚群分析图（略）
2.2 治疗病人CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群百分比均值的回归分析 表1显示，Th1型细胞百分比的均值在治疗过程中呈阶梯状上升趋势， 其与治疗时间在68周内的回归系数为0.741，但无统计学意义，该现象可能与治疗观察时间较长，部分观察病人Th1细胞百分比有所下降以及样本量较小有关； Th2细胞百分比的均值在治疗过程中呈明显的下降趋势， 其与治疗时间在68周内的回归系数为0.847，有统计学意义。
表1 艾滋病人CD4+T淋巴细胞Th1/Th2均值与治疗时间的回归分析（略）
3 讨论
CD4+T淋巴细胞Th1/Th2细胞亚群的平衡漂移可能会削弱机体对HIV的保护性防御机制，导致艾滋病人免疫状态的逐渐恶化［5］。Th1型细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β,Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10。因此，检测Th1/Th2细胞亚群的平衡漂移可以通过ELISA法检测血浆中IFN-γ 、IL-4浓度来判断，也可以通过检测分泌Th1型和 Th2型细胞因子的细胞亚群的比例进行分析。血浆中IFN-γ可以来源于所有的T淋巴细胞，IL-4可以由CD4+T淋巴细胞产生，其它T淋巴细胞亚群、双阳性胸腺细胞、激活的肥大细胞等也能产生。因此，ELISA法只能从总体上检测血浆Th1/Th2相关细胞因子浓度的变化，不能精确判断CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群平衡的改变。胞内细胞因子染色方法是近几年新发展起来的流式分析技术，可以将分泌不同细胞因子或其它抗原物质的细胞亚群区分出来，为我们深入分析各细胞亚群的蛋白质表达差异提供了一个技术平台，是流式分析技术的一个突破［6］。
胞内细胞因子荧光染色分析CD4+T淋巴细胞Th1/Th2平衡改变，方法较为复杂，影响因素较多，需要设置严格的对照才能得到准确的结果。首先需要有细胞刺激效果的对照，推荐先进行CD69的检测，刺激完全的情况下，T细胞CD69的表达应该在90%以上。如果达不到90%，建议不进行细胞因子染色，重新进行细胞培养。同时，每个样本管均要有同型对照管，因为Th2型细胞的比例偏低，不设置同型对照管，结果会有较大的误差。
从10例治疗艾滋病人CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群分析结果看出，随着时间的延长，Th1细胞百分比逐步回升，Th2细胞百分比逐步下降，其中Th2细胞百分比与治疗时间有显著的线性回归关系。这说明Th1/Th2平衡的监测对于判断艾滋病人的治疗效果有较高的参考价值，对于HIV携带者在不同时期Th1/Th2平衡变化的研究还在进行中。
【参考文献】
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［3］ 任莉莉，李富荣，齐晖，等.外周血CD4+淋巴细胞及Th1/Th2细胞因子变化与HIV/AIDS疾病发展的相关性［J］.中国现代医学杂志，2005，15（20）：3123～3125.
［4］ Dobmeyer TS, Dobmeyer R, Wesch D, et al. Reciprocal alterations of Th1/Th2 function in gammadelta T-cell subsets of human immunodeficiency virus-1-infected patients［J］. Br J Haematol, 2002,118(1):282～288.
［5］ Kedzierska K, Crowe SM. Cytokines and HIV-1: interactions and clinical implications［J］. Antivir Chem Chemother, 2001,12(3):133～150.
［6］ Dobmeyer TS, Dobmeyer R, Wesch D, et al. Reciprocal alterations of Th1/Th2 function in gammadelta T-cell subsets of human immunodeficiency virus-1-infected patients［J］. Br J Haematol, 2002,118(1):282～288.
作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020.