儿童患者中检出产ESBLs大肠埃希菌的耐药性和基因分型

【摘要】  目的 了解本地区儿童患者临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的耐药基因型别和耐药性的变化情况。 方法 收集自儿童患者分离鉴定的大肠埃希菌株1 327株，通过K-B法作药敏试验,采用美国NCCLS1999年推荐的抑制剂增强纸片法确认产ESBLs株，并对ESBLs进行初步基因分型。 结果 检出产ESBLs菌株702株，检出率为52.9%，产ESBLs大肠埃希菌对青霉素类、氨曲南及头孢菌素类抗生素耐药率为55.5%～95.0%；PCR初步分型结果,单独携带TEM型基因的占56.7%，单独携带SHV型基因的占15.0%，携带两种基因的占25.8%。 结论 产ESBLs大肠埃希菌检出率逐年上升，具有多重耐药的特点；产ESBLs大肠埃希菌主要携带TEM型和SHV型β-内酰胺酶基因，其中绝大部分产TEM型β-内酰胺酶。

【关键词】  超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) 大肠埃希菌 耐药性 基因分型

　　Analysis of drug resistance and gen typing of ESBLs-producing Escherichia coli isolated from infants.

　　SHI Sheng, XIONG Yan.

　　(Department of Clinical Laboratory, Jiangmen Municipal People’s Hospital, Jiangmen 529000, Guangdong, P.R.China)
   
　　Abstract：Objective  To investigate current resistant status and genetype of ESBLs-producing Escherichia coli in child patients.  Methods  There were 1 327 Escherichia coli strains isolated in clinic, and the ESBLs-producing isolates were identified by K-B method. The DNA of ESBLs-producing Escherichia coli were genetyped by polymerase chain reaction (PCR).  Results  There were 702 ESBLs-producing isolates with a positive rate of 52.9%. The resistant rates of ESBLs-producing Escherichia coli isolates to penicillins,aztreonam and the third generation cephalosporins were from 55.5% to 100%. The results of PCR showed that the rates of TEM type, SHV type and TEM with SHV type in ESBLs-producing Escherichia coli isolates were 56.7%,15.0% and 25.8%, respectively.  Conclusion  The incidence of ESBLs-producing Escherichia coli isolates was increased year by year, and they were multi-resistant. Most of the ESBLs-producing Escherichia coli isolates carry TEM related genes or/and SHV related genes, and the TEM related genes were the most.
   
　　Key words：Extended spectrumβ-lactamases( ESBLs); Escherichia coli; Resistance; Gene typing

　　大肠埃希菌是临床常见的病原菌，也是医院感染的常见细菌之一。近年来，随着第三代头孢菌素的广泛使用，产超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrumβ-lactamases, ESBLs）大肠埃希菌感染日益增多。ESBLs由质粒介导，易在同种属甚至不同种属细菌间传递造成暴发流行，给临床治疗带来许多困难。儿童患者由于免疫机能还不健全，抵抗力较低，是产ESBLs大肠埃希菌的易感人群。为了解儿童患者中检出的产ESBLs大肠埃希菌的耐药情况和基因型，以便采取有效措施加以控制，我们对2004年1月～2006年12月间从儿童患者临床分离的大肠埃希菌进行了耐药性和基因型检测分析，现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  菌株  收集本医院2004年1月～2006年12月自儿童患者临床分离鉴定的1 327株大肠埃希菌。选择其中120株ESBLs阳性菌株进行初步基因分型。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

　　1.1.2  药敏纸片  包括头孢他啶等头孢菌素类药物和亚胺培南、氨曲南、庆大霉素、复方新诺明等共17种，均来源于英国Oxoid公司产品。

　　1.1.3  主要试剂  API鉴定系统（法国Bio-Merieux公司）、TriPure Isolation Regent(Roche公司)、dNTP、Taq酶（Sigma公司）。

　　1.1.4  主要仪器  Biofuge 22R型高速低温离心机、PTC-100PCR仪、DYY-2C型电泳仪、GDS-8000凝胶成像分析仪。

　　1.2  方法

　　1.2.1  ESBLs检测  采用美国NCCLS1999年推荐的抑制剂增强纸片法(表型确认试验)进行和判定结果。

　　1.2.2  ESBLs阳性菌株的药敏试验  采用“K-B”纸片法。取单个菌落配制成0.5号麦氏管浓度的菌液，将配好的菌液均匀涂布于M-H琼脂培养基上，并贴上药敏纸片，在36.5℃下孵育18～24h，测量各纸片抑菌圈直径。

　　1.2.3  产ESBLs菌株基因分型  利用TriPure提取ESBLs阳性菌的DNA，-20℃保存。采用PCR对ESBLs进行基因分型，其中扩增引物：TEM-f：5’-CCGTGTCGCCCTTATTCC-3’，TEM-r：5’-AGGCACCTATCTCAGCGA-3’；SHV-f：5’-ATTTGTCGCTTCTTTACTCGC-3’，SHV-r：5’-TTTATGGCGTTACCTTTGACC-3’。50μl PCR反应体系为：DNA 100ng、2．5mmol／L MgCl2、0.44mmol／L dNTP、0.4pmol／L引物和2.5U Taq酶。扩增条件为“94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s”，35个循环。反应产物在含2％EB琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下观察结果。

　　2  结果

　　2.1  产ESBLs大肠埃希菌的检出率  1 327株大肠埃希菌中检出ESBLs阳性702株，检出率为52.9%。2004～2006年每年的检出率分别为47.9%、52.0%、58.8%。

　　2.2  产酶菌株ESBLs基因PCR检测结果  PCR检测120株产ESBLs大肠埃希菌株中，68株(56.7％)携带TEM型ESBLs基因，18株(15.0％)携带SHV型ESBLs，31株(25.8％)同时携带以上2种ESBLs基因。另外有3株（2.5%）未知基因型(没有检测出)。

　　2.3  产ESBLs大肠埃希菌耐药情况  产ESBLs大肠埃希菌对青霉素类、氨曲南及头孢菌素类抗生素耐药率高达55.5%～95.0%，具有多重耐药特点,详见表1。

　　表1  产ESBLs大肠埃希菌对常用抗生素的耐药率（略）

　　3  讨论
   
　　近年来，随着第三代头孢菌素的广泛使用，产ESBLs大肠埃希菌感染日益增多。ESBLs是β-内酰胺酶基因(主要为SHV、TEM)发生突变导致氨基酸的改变而形成的，由于ESBLs可由质粒携带，通过结合、转化和转导等形式使耐药基因在细菌中传递扩散，从而造成医院内的交叉感染和院外耐药基因的扩散。由产ESBLs大肠埃希菌引起的院内感染爆发流行在国外均有报道［1～3］。儿童患者由于免疫器官发育还不健全，抵抗力较低，极易引起感染，感染后又常接受三代头孢菌素的治疗。多种因素使得儿童患者易感染产ESBLs菌。本结果产ESBLs株在检出的大肠埃希菌中的检出率高达52.9％ ，与文献报道相近［4,5］。
   
　　检出的产ESBLs大肠埃希菌对大多数抗生素耐药率较高，且多重耐药现象较为严重,尤其是对第三代头孢耐药率较高。但从各年的耐药率看大多数有逐年下降的趋势，这可能与近年来临床医生越来越规范用药有关。
   
　　本结果检出产ESBLs大肠埃希菌主要携带TEM型和SHV型基因，其中以TEM型为主,与国内大多数地区的报道基本一致，但所占比率略有差别［6］,与国外有关报道不尽相同［7］。今后我们尚需继续关注产ESBLs株的耐药性及基因型的变化,为临床提供参考。

【参考文献】
  　　［1］ Johann D. D. Pitout, Patrice Nordmann, et al. Emergence of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community［J］. J. Antimicrob. Chemother.,2005, 56:52～59.

　　［2］ Joseph Gangoué-Piéboji, Branka Bedenic, et al. Extended-Spectrum-β-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae in Yaounde, Cameroon［J］. J. Clin. Microbiol., 2005,43:3273～3277.

　　［3］ Nicola A. C. Potz, Russell Hope, Marina Warner,et al. Prevalence and mechanisms of cephalosporin resistance in Enterobacteriaceae in London and South-East England［J］. J. Antimicrob. Chemother., 2006, 58: 320～326.

　　［4］ Ellen S. Moland, Nancy D. Hanson, Jennifer A. Black, et al. Prevalence of Newer β-Lactamases in Gram-Negative Clinical Isolates Collected in the United States from 2001 to 2002［J］. J. Clin. Microbiol., 2006, 44: 3318～3324.

　　［5］ Jesús Oteo, Carmen Navarro, Emilia Cercenado, et al. Spread of Escherichia coli Strains with High-Level Cefotaxime and Ceftazidime Resistance between the Community, Long-Term Care Facilities, and Hospital Institutions［J］. J. Clin. Microbiol., 2006, 44: 2359～2366.

　　［6］ 张晓兵，府伟灵，廖扬，等．临床产ESBLs细菌的耐药特征和基因分型的研究［J］．中华医院感染学杂志，2005,15(4):386～389.

　　［7］ María-Rosario Baquero, Juan Carlos Galán, María del Carmen Turrientes, et al. Increased Mutation Frequencies in Escherichia coli Isolates Harboring Extended-Spectrum β-Lactamases［J］. Antimicrob. Agents Chemother., 2005, 49: 4754～4756.

作者单位：江门市人民医院检验科，广东 江门 529000.