烧伤革兰阴性杆菌产β-内酰胺酶和耐药性的研究

　　【摘要】 目的  了解烧伤感染主要革兰阴性（G - ）杆菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、AmpC酶和金属β-内酰胺酶（mBLA）及其对常用抗生素耐药性情况，指导烧伤医院感染合理用药。 方法  采用双纸片协同试验检测产ESBLs株，头孢西丁三维试验检测产AmpC酶株，头孢曲松三维试验检测同时产ESBLs和AmpC酶株，依地酸二钠协同试验检测产mBLA株，K-B法进行G - 杆菌药敏试验。 结果  348株G - 杆菌产β-内酰胺酶总检出率56.9%，铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的ESBLs株检出率分别为32.8%、47.2%、41.8%，产AmpC酶阴沟肠杆菌占38.9%，铜绿假单胞菌产mBLA株达12.8%;产β-内酰胺酶株G - 杆菌耐药性显著高于非产酶株（P<0.01）。 结论  烧伤病区应重点加强G - 杆菌耐药性监测，及时准确检测产β-内酰胺酶G - 杆菌有助于正确的抗感染治疗。

　　    
　　A study ofβ-lactamases producing by gram-negative bacilli in and drug resistance burns
     
　　Li Pingsong，Huang Jinhua，Chen Xiao.

    Department of Burn and Orthopedics，Clinical College，Yangzhou University，Jiangsu225001.

    【Abstract】 Objective To investigate extended-spectrumβ-lactamases（ESBLs）and AmpCβ-lactamases and metalloβ-lactamases（mBLA）producing by gram-negative bacilli in burns.Mehtods Adopitng double-disk synergy test，modified three-dimensional extract test and the enzyme inhibitor of EDTA-Na2to detect ESBLs and AmpC and mBLA producing strains.Using K-B test to perform the susceptibility testing.Results Among348strains of gram negative bacilli，ESBLs，AmpCβ-lactamases，ESBLs combined with ApmCβ-lactamases and mBLA produc-ing strains were found in122，47，9and20strains，the incidence being35.1%，13.5%，2.6%and5.7%respec-tively.ESBLs were detected in47.2%of Escherichia coli，AmpCβ-lactamases were detected in38.9%of Enter-obacter cloacae and mBLA detected in12.8%of Pseudomonas aeruginosa.The drug resistant rate of antibiotics toβ-lactamases positive strains have significantly higher than negative ones.Conclusions Bums department should moni-tor its drugs resistance status，and it's important to select proper method to detectβ-lactamases in time.
   
　　Key words burn gram negative bacilli β-lactamases nosocomial infection
      
　　烧伤感染尤其是耐药性革兰阴性（G - ）杆菌导致的严重感染，是烧伤患者的主要死亡原因之一，抗生素的使用是治疗G - 杆菌感染的重要手段。近年来，由于广泛应用第三代头孢类抗生素等，细菌在抗生素选择性压力作用下，产生β-内酰胺酶（BLA）如超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、Am-pC酶、金属β-内酰胺酶（mBLA）等，对常用抗生素的耐药，而致烧伤抗感染治疗失败，制约了烧伤治疗水平的进一步提高。我们对烧伤主要G - 杆菌进行了产BLA酶及其耐药性的研究，现报道如下。
　　
　　1 材料和方法

    1.1 菌株来源 2000年1月～2003年12月烧伤科分离出的G - 杆菌共348株，其中来源于创面分泌物247株，血液38株，呼吸道42株，尿道21株，所有菌株按常规分离培养、鉴定菌种。

    1.2 药敏试验 采用K-B法，按NCCLS ［1］ 2003年版标准判读结果，中介值（I）视为耐药。药敏纸片头孢他啶（CAZ），头孢噻肟（CTX），头孢曲松（CRO），头孢西丁（FOX），氨曲南（ATM），头孢吡肟（FEP），头孢哌酮/舒巴坦（CPZ/SPT），哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TAZ），阿米卡星（AMK），环丙沙星（CIP），亚胺培南/西司他丁（IMP），均为英国Oxoid公司产品。

    1.3 质控菌株 以大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853为产BLA阴性对照及药敏质控株;以肺炎克雷伯菌ATCC700603为产ESBLs阳性对照株，阴沟肠杆菌ATCC029m为产AmpC阳性对照株。

　　1.4 产BLA株的检测

    1.4.1 产ESBLs株检测 按双纸片协同试验 ［2］ 。

    1.4.2 产AmpC酶株检测 采用纸片扩散法初筛，头孢西丁三维确证试验 ［3］ 。

    1.4.3 同时产ESBLs和AmpC酶株检测 采用头孢曲松三维试验 ［4］ 。

    1.4.4 产mBLA株检测 采用EDTA-Na 2 酶抑制剂协同试验 ［5］ 。
    
　　2 结果
    
　　348株G - 杆菌产BLA株198株，总检出率56.9%，其中检出产ESBLs122株（35.1%），产AmpC酶47株（13.5%），产mBLA20株（5.7%）。大肠埃希菌产ESBLs株最高，达47.2%，阴汤肠杆菌产AmpC株高达38.9%;铜绿假单胞菌产BLA株占63.2%，且产mBLA达12.8%。348株G - 杆菌产BLA株检出情况见表1。产BLA株G - 杆菌的耐药性显著高于非产酶株，G - 杆菌对IMP的耐药性逐渐升高，对复合酶抑制剂抗生素敏感性明显下降。主要G - 杆菌产BLA株与非产酶株对常用抗生素的耐药性见表2。

　　表1 烧伤G - 杆菌产β-内酰胺酶情况（略）

　　表2 主要G - 杆菌产β-内酰胺酶株对常用抗生素耐药性的影响（略）

    　 3 讨论
    
　　烧伤抗G - 杆菌感染大量使用第三代头孢菌素，在抗生素选择性压力下，产酶菌株不断被检出，且其耐药机制十分复杂，给烧伤临床抗感染治疗带来了极大的困难。目前研究认为G - 杆菌对三代头孢菌素耐药机制主要是产生ESBLs和AmpC酶，不同国家不同医院产BLA株的检出率不一样，检出率的高低表明产BLA株G - 菌的流行状况。AmpC酶属Bush分类中的Ⅰ类酶，常仅对四代头孢菌素如头孢吡肟敏感，不被克拉维酸等酶抑制剂所抑制，对头孢菌素类如头孢西丁耐药;ESBLs酶属Bush分类Ⅱbe型，对酶抑制剂敏感，对头孢菌素类如头孢西丁敏感，而对头孢吡肟耐药;产mBLA酶按Amble结构分类属B类，按Bush功能分类属Ⅲ类BLA，能水解所有β-内酰胺类抗生素包括三、四代头孢菌素及碳青酶烯类，但能被EDTA-Na 2 等金属螯合剂抑制，主要为铜绿假单胞菌产生，是铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗生素耐药的重要机制;产ESBLs、AmpC基因位于质粒上，可以通过转化、转导、转座、接合转移和整合等方式将耐药性在同种或异种菌间传递，引起耐药株的爆发流行 ［6，7］ 。因此必须对细菌产酶情况进行监测。

    本次调查发现348株G - 杆菌产ESBLs株占35.8%，产AmpC株占13.5%。其中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的产BLA株检出率都超过50%，提示耐三代头孢菌素情况十分严重。本科G - 杆菌产ESBLs株的高检出率与三代头孢菌素的广泛应用有关;而产mBLA株的检出率逐渐增高与临床上普遍以IMP替代三代头孢治疗G - 杆菌感染相吻合。耐IMP的铜绿假单胞菌等G - 杆菌的逐渐检出，也宣告了碳青酶烯类抗生素能克服所有其它β-内酰胺类抗生素耐药时代的终结。

    药敏试验显示产BLA株耐药率显著高于非产酶株，提示烧伤G - 杆菌感染不能经验性使用三代头孢菌素治疗，否则造成抗感染治疗的失败和更多产BLA株的定植。对产ESBLs株G - 杆菌严重感染经验用药时，应首选碳青酶烯类，而在产ESBLs株一般感染时，可选用含酶抑制剂或喹诺酮类等;对产mBLA的G - 杆菌感染，可以碳青酶烯类+氨基糖苷类，仍然达到较好的效果。

　　调查显示产ESBLs、AmpC酶和mBLA G - 杆菌与非产酶菌耐药谱明显不同，提示其引起的感染治疗原则有显著区别，所以，及时、准确地检出产ESBLs、AmpC酶及mBLA菌株，对指导烧伤临床抗感染合理用药，遏制耐药菌株的播散，延缓抗生素耐药性的产生，具有重要的临床意义。
    
　　参考文献
    
　1 NCCLS.Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests:Approved standard.Eighth Edition，2003，23（1）:100.

    2 NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.1999，19（36）:75.

    3 Coudron PE，Moland ES，Thomson KS.Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Escherichia coli，klebsiella pneumonia and proteus mirabilis isolates at aveterans medical center.J Clin Mi-crobiol，2000，38（5）:1791-1796.

    4吴伟元，陈民钧，王辉.阴沟肠杆菌去阻遏持续高AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测.中国临床药理学杂志，2001，17（2）:104-109.

    5 Arskawa Y，Shibata N，Shibayama K，et al.Convenient test for scr-caning metallo-beta-lactamase-producing Gram-negative by using thiol compounds.J Clin Microbiol，2000，38:40-43.

    6 倪语星.革兰阴性杆菌产β-内酰胺酶的耐药性问题.中华检验医学杂志，2001，24（4）:201-203.

    7 佘丹阳，刘玉宁.β-内酰胺类抗生素阴沟肠杆菌高产AmpC酶突变的选择作用.中华医院感染学杂志，2003，23（4）:311-314.     

　　作者单位:225001扬州大学临床医学院烧伤整形科