巴尔通体分离培养及生物学特性研究

【摘要】  研究巴尔通体的分离培养及生物学特性。 方法 采用含5%去纤维兔血脑心浸液琼脂培基对收集自云南省的16个县（市）的913份鼠类血液进行巴尔通体分离培养，对疑似菌落用巴尔通体属特异性引物进行聚合酶链反应（PCR）及进行枸橼酸合酶基因（gltA）的379bp片断扩增，从电泳图中出现目标带的阳性菌中随机选出菌株进行电镜检测，同时将其gltA扩增产物行已序列测定并与已知菌株进行比较。 结果 从913份鼠类血液中分离到巴尔通体251份，分离率为27.5%（251/913）。阳性菌落长出时间最早为3d，菌落形态随培养时间延长而改变且特点多样;电镜扫描见多个菌缠绕成团,菌体密集,透射见菌细胞呈短杆状、菌壁较厚。核苷酸序列及相似性比较发现家鼠中巴尔通体有3个基因型。 结论 分离的巴尔通体种类多、生长特性不一、形态多样，呈高度流行及基因型的多样性，一些不明原因的疾病可能与之感染有关。

【关键词】  巴尔通体 分离 培养 生物学特性

　　Culture and isolation of Bartonella and analysis of its biological characteristics.

　　YANG Fa-lian, BAI He-ming, YANG Hui, et al.

　　（Yunnan  Provincial  Institute  of  Endemic  Diseases, Dali 671000, Yunnan, P. R. China）
   
　　Abstract：Objective  To culture and isolate of Bartonella and analysis of its biological characteristics.  Methods  Bartonella strains were isolated from 913 rat blood samples collected from 16 counties in Yunnan Province and inoculated into macconkey agar with 5% non-fiber rabbit blood brain heart infusion broth,then cultured and isolated at 35℃ in 5% CO2  chamber, stained with Gram staininig and examined under microscope to observed their characteristics. The suspected bacteria colonies were amplified by PCR with specific Bartonella introducer to amplify specific gene fragment(379 bp of glt A gene), if the objective band appears on electrophoresis chart it can be judged that the bacteria were the positive strains. The ultrastructure of Bartonella from any positive strain was observed with electron microscopy, and the 379 bp fragment of gltA gene was sequenced and compared with other Bartonella strains.  Results  251 Bartonella strains were isolated from 913 rat blood samples with the isolation rate of 27.5%. The earliest growing period of positive colonies was 3 days. The morphological changes of positive colony were observed along with the elongation of culturing period with diversity of characteristics. Groups of Bartonella were seen twining round through scanning electron microscopy. Small coccobacillus and thicker membrane of Bartonella were noticed through transmission electron microscopy. The three genotypes were found in the Bartonella in Yunnan by sequencial analysis.  Conclusion  Bartonella strains are diverse, and its morphology may metamorphose associated with its broad pathogenesis to human. These findings demonstrate that Bartonella spp is highly pprevalent and its genotype is highly diverse. The findings also indicate further investigations be carried out on elucidate its role in the transmission of unknown infection.
   
　　Key words：Bartonella; Isolation; Culture; Biological characteristics

　　巴尔通体（Bartonella）是一新发现的古老病原体，早在1905年，秘鲁医生Alberto Barton 在血液中发现人类巴尔通体病Oroya热的致病因子；1919年，Battistini、Naguchi 等分离出该病原体；为纪念Barton将这种微生物命名为杆菌样巴尔通体(Bartonella bacilliformis) 。长期以来，杆菌状巴尔通体被认为是巴尔通体属中唯一的一种病原体。直到20世纪90年代才引起人们关注。迄今已发现21种及3个亚种,其中有8个种与人类感染密切相关［1］。分别是五日热巴尔通体(B. quintana)、杆菌状巴尔通体(B. bacilliformis)、汉赛巴尔通体(B. henselae) 、伊丽莎白巴尔通体(B. elizabethae) 、格雷汉巴尔通体(B.grahamii) 、B. clarilgeiae 、B washoensis［2］和B. vinsonii arupensis［3］,以及最近报道的B. koehlerar［4］。由巴尔通体感染引起的疾病谱比较复杂，主要有猫抓病、卡里翁氏病、心内膜炎、杆菌性血管瘤和慢性巴尔通体血症等。另外，巴尔通体有时还会引起视网膜炎、脑炎、肾小球肾炎和肺炎等，给人类健康带来巨大的威胁。在1997年第一届巴尔通体国际会议上，该病原被正式确认为人类新发现的致病菌而日益引起国内外学者的关注［5］。
   
　　我国相关研究开展较晚,1999年10月云南省地方病防治所与美国疾病控制中心虫媒传染病部联合在云南鼠群中首次开展了调查，证实巴尔通体在云南普遍存在［6］。随后北京、山东、福建等地也分别开展了相关调查,先后均证实有巴尔通体感染存在。自1999年云南首次在鼠群发现巴尔通体,并对16个县（市）的黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠、斯氏家鼠、大绒鼠、齐氏姬鼠、中华姬鼠、大林姬鼠、小家鼠、锡金小鼠、灰麝5个属的11个鼠种中先后分离到巴尔通体一百多株［7～9］。其中近百株经巴尔通体gltA基因的379bp片断进行了序列测定,并提交基因库。序列分析表明总体可分为3个基因型。巴尔通体种类多，形态多样，培养过程复杂，其间形态多变，这可能与巴尔通体感染引起多种疾病有关［10］。因此,为加深认识,我们对巴尔通体分离培养及生物学特性。

　　1  材料和方法

　　1.1  鼠类全血标本采集  采用布笼、电猫、挖洞、灌水驱逐等方法捕捉活鼠，用3%～5%的煤皂酚溶液消毒其皮肤，经股动脉取血（非抗凝血），于-196℃的液氮容器中备用。

　　1.2  阳性对照菌株  巴尔通体菌株YJ41,分离自云南盈江,经PCR及测序技术证实为巴尔通体。

　　1.3  两性霉素  购于美国生产的品名为amresco,每瓶原装为100mg，使用时加入灭菌水20ml，浓度为0.5%（5mg/ml）。

　　1.4  培养基

　　1.4.1  BHI液体培养基  脑心浸液（Brain Heart Infusion）购于美国Becton,Dickinson 公司。按3.7g BHI加入90ml蒸馏水的比例，充分混均，121℃ 15min高压灭菌后，再加入5mg/ml的两性霉素溶液10ml，两性霉素在BHI溶液中的最终浓度为0.05%（500μg/ml），制成BHI液体培养基，置4℃冰箱备用。

　　1.4.2  BHI固体培养基  按37g BHI和15g琼脂粉（购于上海化学试剂采购供应站分装厂，为日本进口分装），加入900ml蒸馏水的比例，充分混均，121℃ 15min高压灭菌，待温度降至40～50℃左右，加入100ml新鲜兔溶血（50ml已去纤维和脂肪后的兔心脏血加50ml灭菌水），制成5%的兔血心浸液琼脂培基 ，后分装于培养皿中，置37℃温箱中做48h的无菌试验，确认无污染置4℃冰箱备用。

　　1.5  接种与保存  用BHI液体培基将被检鼠全血1:4稀释（鼠全血0.25ml加BHI至1ml），后取100μl，接种于BHI固体培基中，置35℃含5%CO2的培养箱中培养，每天观察其生长情况并记录，最长达40d，对疑似巴尔通体菌落进行1～4次 纯分后，收集纯菌培养物于含BHI液体培基和甘油各50%的冻存管中，冻存于-70℃冰箱。

　　1.6  培养物检测

　　1.6.1  菌落观察  在初次分离培养后常需1～5wk才能长出白色、干燥的小菌落黏稠状圆形凸起，光滑或粗糙的菌落均作为疑似菌落，并作涂片革兰氏染色。

　　1.6.2  PCR的检测鉴定  挑取疑似菌落收集于含100μl去离子水（pＨ8.0）的1.5ml离心管中，混匀，100℃煮8min，10 000r/min离心15min，上清液即为模板，制成模板后，-20℃保存备用。聚合酶链反应（PCR）采用的是具有巴尔通体属水平特异性的引物（BhCS781.p-BhCS1137.n, 由上海生物工程研究所合成），上游引物BhCS781.p硷基序列为：5′-GGG GAC CAG CTC ATG GTG G-3′,下游引物BhCS1137.n硷基序列为：5′-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3′，对枸橼酸合酶基因（gltA）的379bp片断进行扩增，电泳图中出现目标带即判断为阳性菌株。使用的扩增仪是PTC-150型DAN仪(MJ Research,Watertown, MA)。PCR反应体系总量为20μl：含Pfu MasterMix17μl(北京天为时代科技有限公司)，上下游引物各1μl，模板1μl。扩增程序为95℃ 2min, 48℃ 30s, 72℃ 30s, 再按94℃ 30s, 48℃ 30s,72℃ 30s行30个循环，72℃延伸5min结束。取6μl PCR扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶经80～100V 40min电泳，设标准分子量（Marker,50bp Ladder）,阴性对照（用去离子水代替模板）。使用一次性凝胶成像仪观察扩增带并照相。

　　1.7  电镜观察  收集经PCR证实是巴尔通体菌中随机选出的株菌（在培养基中的长出时间均为第3d）分别置于电镜固定液中, 送至昆明医学院电镜室检测。

　　1.8  PCR产物核酸序列测定及序列分析  先后将选出菌株的gltA扩增产物送至上海生物工程研究所测序。从BankIt程序在线将序列提交GenBank。网上利用核酸序列比对程序BLAST（美国国家生物技术信息中心，www.ncbi.nlm.nih.gov）进行核酸序列同源性搜索，用CLUSTALX1.83进行多序列匹配比对，然后用PHYLIP3.62软件进行系统进化树的构建。

　　2  结果

　　2.1  巴尔通体分离培养情况  以景东﹑龙陵、盈江、南华为例见表1。阳性菌落长出时间最早为3d，与文献报道一致。最迟32d，多数为1～2周长出，占70.2%（33/47）。

　　表1  47份阳性菌落长出时间（略）

　　Table 1  The growing time of 47 positive colinies

　　2.1.1  菌落形态观察  接种后24h开始每天观察培养基1次，最初观察到微小（Φ＜1.0 mm)的圆形凸起菌落，呈灰白色、略透明、边缘光滑或粗糙，菌落数多少不等，在10～1 000cfu以上；培养时间延长,可以见到菌落中央呈现“凹陷”、菌落表面变粗糙，有些经接种环刮起后可见培养基生长处留下圆形小坑，是巴尔通体菌落向培养基中下陷生长造成，与Anderson的文献报道一致［11］；有些菌落不黏附或稍黏附于培基表面,与Michael的文献报道一致［12］；有些呈蜡状不易挑取，挑起后不易黏附在玻片上。传代培养后菌落生长较快，菌落较原代大，少数可达2mm，且有些呈菜花样生长(图1)。

　　图1  传代75d呈菜花样生长的菌落（略）

　　Fig 1  Culture 75 day,larger colony with an irregular edge

　　2.2  染色镜检  巴尔通体是一种革兰氏染色阴性杆菌，但在革兰氏染色下菌体细小，而且染色效果差，Gimenez染色菌体呈紫色、细小、微弯曲的杆菌(图2)。最佳方法是warthin-stany涂片银染色法。

　　图2  Gimenez染色菌体呈紫色、细小、微弯曲的杆菌（略）

　　Fig 2  Purple,small,curved bacilliformis

　　2.3  电镜观察

　　2.3.1  巴尔通体菌的扫描电镜超微结构  绝大多数菌均缠绕成团,每个菌只探出个头(图3)。用超声波冲击后,有少量孤立的巴尔通体菌,似圆球形外围呈云雾状,中间凹陷(图4)。

　　图3  巴尔通体的扫描电镜图（略）

　　Fig 3  Bartonella scanning electron microscopy

　　图4  巴尔通体的扫描电镜图（略）

　　Fig 4  Bartonella scanning electron microscopy

　　2.3.2  巴尔通体菌的透射电镜超微结构  电镜下菌细胞呈短杆状、菌壁较厚(图5)。

　　图5  巴尔通体的透射电镜图（×80000）（略）

　　Fig 5  Bartonella  transmission electron microscopy

　　2.4  PCR扩增结果  用具有巴尔通体属水平特异性引物BhCS781.p-BhCS1137.n扩增，出现目标带（约为380bp），(图6)。

　　图6  PCR扩增产物1.5%琼脂糖电泳图（略）

　　Fig 6  Identification of Bartonella by PCR

　　1为阳性对照;2为空白对照;3～10为目标带;M为DNA分子量标准。

　　2.5  核苷酸序列及相似性比较  目前发现家鼠中巴尔通体有3个基因型（B.elizabethae;B.tribocorum and B.Yunnanensis）。以澜沧所测5株菌序列为例，构建系统进化树(图7)。

　　图7  澜沧5株菌gltA序列以及数据库中参比序列构建的系统发育树（略）

　　Fig 7  Phylogenetic relationship between Sequences Analysis of gltA in Lan Cang 5 Bartonella strains and other Bartonella in GenBank compared

　　3  讨论
   
　　阳性菌落长出时间最早为3d，培养时间延长可以见到菌落中央呈现“凹陷”、菌落表面变粗糙。可能培养时间延长,营养消耗,菌落中央生长相对缓慢和菌落形态发生变异而至，需进一步研究。有些经接种环刮起后可见培养基生长处留下圆形小坑；有些菌落不黏附或梢黏附于培基表面；有些呈蜡状不易挑取、挑起后不易黏附在玻片上；有些呈菜花样生长。文献报道，汉赛巴尔通体初代分离菌落大小一致，呈灰白色、凸起、粗糙并嵌入琼脂内，传代后多呈光滑黏稠状；五日热巴尔通体，常为大小不一、光滑、扁平、有光泽、不透明、也不致琼脂凹入菌落。说明巴尔通体种类多、生长特性不一、形态多样。这是巴尔通体对人类致病性呈疾病谱广泛有关系，有待深入研究。有些菌不黏附于培基，挑起后不易黏附在玻片上，是因为巴尔通体含较多脂质，亲水性弱所致［13］。
   
　　从云南鼠类分离到B.elizabethae、B.tribocorum和B.Yunnanensis 3种巴尔通体菌株。B.elizabethae是1999年美国分离到的，B.tribocorum是法国1998年分离到的，B.Yunnanensis是首次在我国分离到的变异株。说明云南巴尔通体的高度流行及基因型别的多样性，一些不明原因的疾病可能与巴尔通体的感染有关。需要进行系统的调查研究。
   
　　该次随机选出5株菌对其PCR产物测序，将所测核酸序列进行相似性比较及序列分析。结果5株菌的gltA区序列在进化关系上具有较近的亲缘关系。其中LC52株与B.sp.RN52BJ-DQ884394菌株在一个分枝上。其他LC84  LC04  LC80  LC40  4株与B.tribocorum-AJ005494菌株在一个分枝上。一方面说明B.tribocorum为该地的主要优势菌；另一方面不同地区优势菌不同，引起的疾病表现形式不一，有待进一步证实。
   
　　我国目前无电镜观察方面的报道，其具有直观、形象等特点。扫描电镜下，绝大多数菌均缠绕成团。可能是菌体之间的自动凝集现象所致。Pierre等报道［14］菌毛蛋白与在液体悬浮或肉汤培养基中的自动凝集现象有关。杆菌样巴尔通体有1～10根单端鞭毛，长3～10μm；也有少数菌体可同时具有次极端或侧鞭毛。初分离的汉赛巴尔通体有菌毛，传代后则失去菌毛。此次尽管我们只初步观察，但为今后深入研究积累资料。

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作者单位：云南省地方病防治所,云南 大理 671000.