乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达TLR4的影响

【摘要】  　　目的 探讨乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的影响。 方法 采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2、HepG2-X和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度及阳性细胞率，采用荧光定量PCR检测三种细胞TLR4的mRNA水平。结果 肝癌细胞株HepG2.2.15上TLR4表达的平均荧光强度及阳性细胞率分别为(18.24±8.18)、(17.79±9.46)%，TLR4 mRNA水平为(0.62±0.11)，明显高于HepG2-X和HepG2细胞的相应值（P'<0.001），而HepG2 和HepG2-X两者之间的表达则无统计学差异（P>0.05）。 结论 乙型肝炎病毒可直接上调细胞TLR4的表达，这种上调是通过乙型肝炎病毒非X基因或蛋白来完成的。

【关键词】  TLR4；乙型肝炎病毒；流式细胞术；荧光定量PCR

　　Effects of hepatitis B virus on the expression of TLR4 in hepatocellular carcinoma line HepG2.

　　GUO Yun-wei, LI Yong-wei, WEI Xiu-qing, et al.
　　1.The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong, P. R. China

    Abstract：Objective  To investigate the effects of hepatitis B virus on the expression of TLR4 in hepatocellular carcinoma cell line HepG2.  Methods  Immunofluorescence flow cytometry was used to detect TLR4 positive cells and mean fluorescence intensity (MFI) in hepatocellular carcinoma cell lines HepG2, HepG2-X and HepG2.2.15. The levels of TLR4 mRNA in three cell lines were determined by real-time fluorescence quantitative PCR (RFQ-PCR).  Results  MFI of TLR4 (18.24±8.18), TLR4 positive cell percentage (17.79%±9.46%) and the level of TLR4 mRNA (0.62±0.11) in HepG2.2.15 cells were significantly higher than those in HepG2 and HepG2 –X (P′<0.001). There was no difference between the exerssion of HepG2 and HepG2 –X (P>0.05).  Conclusion  Hepatitis B virus can up-regulate the expression of TLR4 in HepG2 cells through its non-X protein.

    Key words：TLR4; Hepatitis B virus; Flow cytometry; Fluorescence quantitative PCR

    Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）属于天然免疫系统的重要分子，可通过识别病原相关的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引发信号传导导致炎症介质的释放，并最终激活获得性免疫系统［1］。乙型肝炎病毒侵入人体后，免疫介导的肝损伤是乙型肝炎发病的主要机制，在我们的前期研究发现Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）和TLR4在慢性乙型病毒性肝炎或慢性重型病毒性肝炎外周血单个核细胞和组织中存在上调［1,2］，但是它们的上调受那些因素的影响，目前尚不清楚。本文分别在蛋白水平及mRNA水平检测肝癌细胞株HepG2，HepG2-X和HepG2.2.15的TLR4表达，研究乙型肝炎病毒及其成分对肝细胞表达TLR4的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  细胞株 

　　肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15（HepG2转染乙型肝炎全病毒基因组形成）为中山大学附属第三医院传染科实验室保存，肝癌细胞株HepG2-X为HepG2转染乙型肝炎病毒X基因组形成，已由中山大学附属第三医院传染科杨林教授前期建立并保存。

　　1.2 主要试剂及仪器 

　　Trizol试剂（Invitrogen公司）、实时荧光定量逆转录-PCR试剂盒SuperScriptTM III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit（Takara公司），PE-anti-human TLR4（鼠源性）、PE-mouse IgG 2a（美国Ebioscience公司），BD FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD公司），ABI 7000 Rael Time PCR扩增仪（美国ABI公司）。

　　1.3 细胞培养及细胞总RNA提取 

　　细胞培养液为含10%灭活新生牛血清的DMEM培养基，HepG2.2.15细胞培养液另加G418，常规培养肝癌细胞株HepG2，HepG2-X及HepG2.2.15并传代，然后取对数生长细胞以104/ml接种于6孔板中，至细胞贴壁融合90%以上时每株各取4孔消化收集细胞，进行流式细胞TLR4的表达检测，余2孔用Trizol法进行总RNA提取，核酸蛋白紫外分析仪检测RNA质量和浓度，要求D260／D280在1.8～2.0，并调整RNA浓度至1ng/μl。以上实验重复2次。

　　1.4 引物设计合成和标准曲线的构建 

　　TLR4：5'-AGGATGATGCCAGGATGATGTC-3'，5'-TCAGGTCCAGGTTCTTGGTTGAG-3'（198bp）；内参照β-actin：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'（186bp），由Takara生物技术有限公司设计并合成。取中山大学附属第三医院传染科实验室建立并保存的pBluescript-HBV质粒，核酸蛋白紫外分析仪核酸定量，1：10倍比稀释作为标准品，与待测样本同时进行荧光定量PCR反应，以其域值循环数(Ct，threshold cycle)与不同浓度标准品的对数值拟合作图，建立标准曲线。

　　1.5 细胞TLR4 mRNA的定量检测 

　　采用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时一步逆转录-PCR反应。反应体系50μl，包括上下游引物各1μl（浓度0.2μm），待测样本总RNA或标准品4μl，加入96孔板，每个待测样本设3个复孔，于ABI 7000 Rael Time PCR扩增仪进行反转录及PCR反应。反转录反应：42℃ 15min，95℃ 2min；PCR反应：95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环。根据标准曲线，软件自动计算出待测样本中TLR4和β-actin的mRNA含量，以TLR4和内参β-actin mRNA含量的比值作为评价TLR4表达水平的指标，TLR4和内参β-actin PCR扩增产物产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.6 细胞TLR4蛋白水平的表达检测 

　　采用直接免疫荧光流式细胞术。将待测细胞调为浓度1×106～5×106/ml，PBS洗涤细胞，分别加入PE-anti-human TLR4 10μl和细胞100μl，每管设同型对照，以PE-mouse IgG代替PE-anti-human TLR4，室温、避光孵育20min。PBS洗涤后，配成约106/ml液，用FCM及Cellquest软件分析TLR4的平均荧光强度及阳性细胞率。以上实验重复2次。

　　1.7 统计学分析 

　　采用SPSS12. 0统计软件，两组间计量资料采用t检验。

　　2 结果

　　2.1  细胞株HepG2、HepG2-X及HepG2.2.15上TLR4蛋白水平的表达 

　　免疫荧光流式细胞结果显示HepG2.2.15细胞上TLR4表达的平均荧光强度及阳性细胞率均明显高于HepG2 和HepG2-X，而HepG2 和HepG2-X两者之间的表达则无统计学差异（P'＞0.05）（见表1）。由图1示例可见，1例HepG2细胞的TLR4表达曲线与同型对照基本重叠，显示此HepG2细胞基本无TLR4表达；而1例HepG2.2.15细胞的TLR4表达曲线较同型对照左移，显示此HepG2.2.15细胞有TLR4表达。见图2。表1  TLR4在细胞株HepG2、HepG2-X及HepG2.2.15上的表达（略）注:与HepG2、HepG2-X相比，P<0.001。

　　2.2 细胞株HepG2、HepG2-X及HepG2.2.15上TLR4 mRNA水平的表达 

　　根据标准曲线和内参β-actin，得出各细胞株TLR4 mRNA的表达值，结果显示，HepG2.2.15细胞上mRNA含量为0.62±0.11，明显高于HepG2（0.17±0.05） 和HepG2-X（0.14±0.04）（P<0.001），而HepG2 和HepG2-X两者之间的含量则无统计学差异（P＞0.05）。扩增曲线显示样本扩增效率良好，溶解曲线呈单峰状并基本重叠，说明扩增出单一目的物质，TLR4和内参β-actin PCR扩增产物产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符。

　　3 讨论

    TLR是连接天然免疫及获得性免疫系统的重要桥梁［1］，其中TLR4是该家族中目前研究得较清楚的成员，它主要表达在巨嗜细胞、中性粒细胞、树突状细胞及内皮细胞上，它识别PAMPs或相关内源性配体后，可引起细胞因子和炎症介质的合成与释放，促使免疫细胞成熟、分化和功能化，并在部分研究中提示TLR4能促进机体对病毒的清除［4］。
   
　　免疫介导的肝损伤是多种慢性肝病发病的主要机制，近来的研究和我们的前期实验显示，TLR4信号可能在肝脏疾病包括丙型和乙型病毒性肝炎的发生及免疫介导的肝细胞损伤中起重要作用。Machida K等［5］的研究发现，在感染HCV的患者外周血单个核细胞中，TLR2及TLR4均有明显的升高，并认为HCV感染后B细胞分泌IL-6及TNFβ的能力明显加强，这一功能是由TLR4介导的。Mozer-Lisewska等［6］对感染HCV的儿童患者的研究中发现，病肝组织上有TLR2及TLR4的表达，而正常肝组织则无，认为TLR在儿童丙型病毒性肝炎免疫清除及损伤中起重要作用。而我们的前期实验发现，TLR4在慢性乙型病毒性肝炎肝组织上存在高表达，而它在外周血单个核细胞上的高表达与慢性乙型肝炎患者的重型化有关［2］。但TLR4的表达上调究竟受那种或哪些因素的影响，焦点首先聚集在病毒本身。
   
　　Machida K等发现，在HCV转染的Raji细胞系中，与未转染HCV的Raji细胞相比，TLR4的表达有明显的升高，认为HCV可直接上调Raji细胞TLR4的表达，在进一步的研究中发现，HCV还可上调Huh7和HepG2细胞TLR4的表达，而这一功能是由丙型肝炎病毒NS5A蛋白实现的，得出结论，HCV通过NS5A蛋白激活肝细胞和B细胞TLR4的表达，进而诱发IL-6和TNF-α的表达［5］。
   
　　为了证实乙型病毒性肝炎与TLR4的相关性，以及了解乙型肝炎病毒及其成分对TLR4的调节性，我们分别从蛋白水平和mRNA水平检测了3个具有代表意义的细胞株HepG2、HepG2-X（HepG2转染乙型肝炎病毒X基因形成，已证实稳定表达乙型肝炎病毒X抗原）及HepG2.2.15 （HepG2转染乙型肝炎病毒全病毒形成）上TLR4的表达水平。结果显示，HepG2.2.15细胞上TLR4 的表达明显高于HepG2 和HepG2-X，而HepG2 和HepG2-X细胞TLR4 的表达则无显著性差异，说明乙型肝炎病毒可直接上调TLR4的表达，这与Machida K［5］等关于HCV的研究相似，而其成分X基因或蛋白对TLR4的表达无作用，间接说明乙型肝炎病毒对TLR4的上调是通过非X基因或蛋白来完成的。至于乙型肝炎病毒上调TLR4的表达后，能否导致TNF-α及IL-6等的分泌进而引起一系列的病理生理过程，则需进一步的实验证实。
   
　　基于研究结果，我们期望干扰TLR4信号途径有可能改变病毒性肝炎的免疫损伤过程，而这种调节可尝试通过乙型肝炎病毒的非X基因或蛋白信号途径来实现。

【参考文献】
  　　［1］Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway C A．A human homo1ogue ofre, 1997, 388(6640): 394～397.

　　［2］尉秀清，郭云蔚，文卓夫，等. 慢性重型乙型肝炎患者外周血单核细胞Toll样受体4的变化及其与IL-6的关系［J］. 中国病理生理杂志，2007，23（8）：1563～1565.

　　［3］郭云蔚，尉秀清，杨绍基. 乙型肝炎与Toll样受体2的关系密切［J］. 中华肝脏病杂志，2007，38(2)：79～81.

　　［4］Kurt-Jones E A, Popova L, Kwinn L, et al. Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus［J］. Nat Immunol, 2000，1(5): 398～401.

　　［5］Machida K, Cheng KT, Sung VM, et al. Hepatitis C virus induces toll-like receptor 4 expression, leading to enhanced production of beta interferon and interleukin-6［J］. J Virol, 2006, 80: 866～874.

　　［6］Mozer-Lisewska I, Sluzewski W, Kackzmarek M, et al. Tissue localization of Toll-like receptors in biopsy specimens of liver from children infected with hepatitis C virus［J］. Scand J Immunol, 2005, 62: 407～412.

作者单位：中山大学附属第三医院，广东 广州 510630.