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【摘要】 目的 分析大肠埃希菌临床分离株产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的主要基因型。方法 用表型确定的临床分离产ESBLs的大肠埃希菌47株，分别用TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9扩增引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增，并对PCR产物进行序列分析。结果 PCR扩增结果显示TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9的阳性率分别为59.57％、4.26％、17.02％、19.15％和82.98％，CTX-M型总阳性率为93.62%，序列分析证实扩增为目的产物。结论 47株ESBLs大肠埃希菌的主要基因型是CTX-M型和TEM型，且同时携带2种以上基因的菌株占所测菌株的63.83%，需引起临床的高度重视。
【关键词】 大肠埃希菌；超广谱β-内酰胺酶；基因分型
Genotyping analysis of extended-spectrum β-lactamases(ESBLs) producing Escherichia coli clinically isolated.
HUANG Lie,WEI Jie-hong, ZHANG Yin-hui, et al.
Laboratory Department of Affiliated Shenzhen Futian Hospital of Guangdong Medical College ,Shenzhen 518033, Guangdong, P.R. China
Abstract：Objective To investigate the characteristics of genotype of extended-spectrum β-lactamases(ESBLs) producing clinical isolates of Escherichia coli. Methods The genes of 47 strains of ESBLs producing isolates of Escherichia coli with confirmed phenotype were amplified by PCR using primers specific for TEM,SHV,CTX-M-1,CTX-M-2 and CTX-M-9 respectively and the PCR products were confirmed to be objective products by DNA sequencing. Results The PCR positive rate was 59.57% for TEM, 4.26% for SHV, 17.02% for CTX-M-1, 19.15% for CTX-M-2, and 82.98% for CTX-M-9 respectively. Among them, the CTX-M-type was 93.62% totally. Conclusion CTX-M and TEM were the prevalent genotype of 47 ESBLs producing isolates of Escherichia coli. Among all strains, 63.83% carry more than 2 ESBLs genes.
Key words：Escherichia coli;Extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs);Gene typing
超广谱β-内酰胺酶( ESBLs) 是由质粒介导的能使细菌对三代头孢菌素类、单酰胺类及青霉素类耐药的一类酶，可在菌株间转移或传播［1,2］。由于β- 内酰胺酶类抗生素的广泛应用及不合理使用，耐药菌株迅速增加，尤其产ESBLs 细菌引起的耐药问题更为严重。大肠埃希菌是产ESBLs 的主要代表菌株。为了解本院感染ESBLs大肠埃希菌的基因型特征，本文应用聚合酶链反应(PCR)分别检测47株产ESBLs大肠埃希菌3种最常见的耐药基因TEM、SHV和CTX-M型。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 菌株来源
取自深圳市福田区人民医院微生物实验室2005～2006年期间经法国生物梅里埃ATB Expression细菌分析系统鉴定的临床分离株。采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的纸片扩散表型确证方法［3］，筛选出47株产ESBLs大肠埃希菌菌株。
1.2 主要化学试剂
DNAfast200小量基因组DNA快速抽提试剂(飞捷生物产品)；TaqDNA聚合酶、dNTPs及PCR Mix 缓冲体系(Fermentas 2X PCR Master Mix)；引物（上海生工合成）；DNA marker Ⅳ(天为时代产品)；琼脂糖(英国OXOID产品);SYBR Green 1(美国Molecular Probes产品)。
1.3 细菌质粒DNA的提取
所有产酶菌株细菌质粒DNA采用飞捷生物DNAfast200试剂，严格按照说明书操作提取。
1.4 PCR扩增
PCR引物根据文献［4,5］分别合成用于扩增耐药基因的引物（由上海生工生物科技有限公司合成），见表1。PCR反应条件：96℃预变性 3min ， 94℃变性1min，50℃退火 40s，72℃伸延1.5min， 40次循环 ，72℃伸延5min。 PCR体积为50μl：含2X PCR Master Mix 25μl，DNA模板1μl，上、下游引物各1μl，H2O 23μl。
1.5 PCR产物电泳及测序
PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下观察结果并照相，然后将扩增产物送上海生工公司测序，结果与Gene Bank颁布的序列进行比较分析。
2 结果
2.1 PCR扩增结果及产物分析
产ESBLs大肠埃希菌5种耐药基因PCR扩增片段凝胶分析见图1，扩增片段大小与设计一致。所有5种耐药基因PCR扩增片段经核酸测序及GenBank库对比，与相应基因的同源性均大于97%。 表1 PCR引物及反应条件基因名称引物序列扩增片段TEMF:5＇-ATAAAATTCTTGAAGAC-3＇
1076bpR:5＇-TTACCAATGCTTAATCA-3＇SHVF:5＇-GGGTTATTCTTATTTGTCGC-3＇
930bpR:5＇-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3＇CTX-M-1F:5＇-CGGTGCTGAAGAAAAGTG-3＇
354bpR:5＇-TACCCAGCGTCAGATTAC-3＇CTX-M-2F:5＇-ACGCTACCCCTGCTATTT-3＇
780bpR:5＇-GCTTTCCGCCTTCTGCTC-3＇CTX-M-9F:5＇-GCAGATAATACGCAGGTG-3＇
393bpR:5＇-CGGCGTGGTGGTGTCTCT-3＇图1 产ESBLs(+)大肠埃希菌株耐药基因PCR扩增产物电泳结果
M：DNA marker; l：CTX-M-9; 2： CTX-M-2; 3：CTX-M-1; 4： SHV; 5：TEM.
2.2 ESBLs基因型分析
47株产ESBLs大肠埃希菌中含耐药基因TEM型28株、SHV型2株、CTX-M型44株，含多种耐药基因菌株达26株（占55.32%）。详细基因型分布见表2。表2 47株大肠埃希菌产ESBLs的基因型分布基因型菌株数构成比(略)
2.3 CTX-M基因型分类
在所检出的44株含CTX-M型阳性菌株中，CTX-M-1型8株(占18.18％)，CTX-M-2型9株(占20.45％)，CTX-M-9型39株(占88.64％)，其中有1株共同带有CTX-M-1和CTX-M-2型基因，5株共同带有CTX-M-2和CTX-M-9型基因，3株共同带有CTX-M-1、 CTX-M-2和CTX-M-9型基因，其余35株CTX-M型菌株均带有单个CTX-M型基因。
2.4 并由本研究47株产ESBLs大肠埃希菌原始药敏结果进一步证实，头孢噻肟耐药率（77.10%）明显高于头孢他啶耐药率（57.90%），同时大肠埃希菌中产ESBLs菌株的耐药率显著高于不产酶株。见表3。表3 大肠埃希菌对20种抗生素的耐药率抗生素ESBLs（略）
3 讨论
ESBLs为Bush 2be型，Ambler A类酶，其水解的底物包括青霉素类、第一至三代头孢菌素(部分酶可水解第四代头孢菌素)、单环β-内酰胺类抗菌药物，但不能水解β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合药物、头霉素类及碳青酶烯类抗菌药物［6］。ESBLs基因型有TEM型、SHV型、非TEM非SHV型(包括CTX-M型和OXA型)等，大多数为TEM型和SHV型，由广谱酶TEM-1/TEM-2和SHV-1的酶活性区经过1～4个关键氨基酸突变衍生而来．是新型广谱抗生素选择性压力的结果。CTX-M型ESBLs自20世纪90年代初以来不断被发现，该型ESBLs以水解头孢噻肟、头孢曲松的活性显著高于头孢他啶、氨曲南为特征［7］。产超广谱β-内酰胺酶的细菌呈世界性流行，但不同地区流行的ESBLs基因型不同。其中TEM和SHV型是目前世界上大多数国家如美国、英国、法国等欧美国家流行的主要基因型［6,8］，CTX-M型多见于南美、东欧和亚洲等国家，而我国大陆则以CTX-M型为主并兼有SHV、TEM型报道［9～11］。本项研究主要基因型为CTX-M型（93.62%），其次为TEM型(59.57％)和SHV型(4.26％)，其中CTX-M型亚型分组有CTX-M-9(88.64％)、CTX-M-2(20.45％)和CTX-M-1(18.18％)，实验结果与我国文献报道基本一致［10,11］。ESBLs菌株分离率有所差异，这种差异可能与不同医院、地区使用第三代头孢菌素的种类、数量及时间不同而造成对ESBLs的筛选及诱导不同有关。另外现在已知绝大多数ESBLs基因定位于宿主菌染色体外遗传物质-质粒的DNA序列中，质粒对于介导ESBLs基因在同种属或不同种属革兰阴性菌的转移中发挥着主导作用，所以不同地区基因型的差异也可能与不同的质粒参与介导ESBLs基因转移有关。由于我国使用第三代头孢菌素主要为头孢噻肟而国外为头孢他啶，也导致我国ESBLs基因分布主要为CTX-M的结果。
从本研究基因型分布显示47株产ESBLs大肠埃希菌中同时携带4种基因有3株（6.38%），同时携带3种基因有3株（6.38%），同时携带2种基因有24株（51.06%），单独携带1种基因有17株（36.17%）。总之，同时携带2种基因以上有30株,占总数的63.83%，从基因水平显示了产ESBLs细菌耐药基因的复杂性。鉴于ESBLs基因型流行的复杂和多样化且有区域性流行，不同地区有必要对本地区进行监测，以为预防、控制和治疗提供依据。因此必须及时、准确对ESBLs介导的耐药性及其耐药基因进行检测，以指导临床合理使用抗生素，控制耐药菌株的蔓延。
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