Survivin基因在大肠癌中的表达

【摘要】  　　目的 探讨Survivin基因在大肠癌中的表达。 方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测20例大肠癌及其癌旁组织survivin mRNA表达情况。结果 65％大肠癌组织表达survivin mRNA,而癌旁组织25％表达。 Survivin基因表达与肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移及分化程度无明显关系。结论 Survivin基因在大肠癌发生发展中可能起作用,Survivin表达上调和端粒酶激活可能通过各自不同的信号途径在大肠癌变中发挥协同作用。

【关键词】  Survivin基因;大肠癌;表达

　　Expression of Survivin gene in larger intestinal cancer patients.

　　CAO Bi-hong, LIU Ji-hong, ZENG Hong, et al.

　　Huizhou Municipal Central People’s Hospital, Huizhou 516001, Guangdong, P.R. China

    Abstract：Objective  To investigate the expression of survivin in colorectal cancer (CRC) patients.  Methods  The expression of survivin mRNA in 20 colorectal cancer patients and adjacent tissues was detected by RT-PCR.  Results  The expression of survivin  mRNA was detected in a 65% of the samples of CRC patients, significantly higher than that of the adjacent tissues (25%).  There no significant correlation of survivin gene expression with the tumor size, invasivesdepth, lymphonode metstsis and extent of differentiation were observed.  Conclusion  The up-regulation expression of survivin gene in CRC patients shows that survivin may play a role in the pathway of carcinogenesis. The up-regulation expression of survivin and the activtion of telomerase may have a cooperative effect in the carconogenesis through their respective signal pathway.

    Key words：Survivin gene; Colorectal cancer; Experssion

    生存素(Survivin)是新近发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新的一员，其抗凋亡作用的机制可通过Caspase途径和非Caspase途径实现［1］，属于一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员，survivin同时具有肿瘤组织特异性高表达的特，研究已证实多种常见肿瘤如胃癌、大肠癌、乳癌、肺癌、肝癌等均存在Survivin异常表达［2］，但在正常成人组织不表达或呈低表达。本文采用 RT-PCR法检测大肠癌及癌旁组织中survivin mRNA表达情况，并探讨了生存素的表达与大肠癌临床病理的关系。

　　1  材料与方法

　　1．1  标本采集 

　　选取2002年8月～2005年6月经病理组织学诊断为大肠腺癌手术切除标本20例(男11例，女9例)，平均55．8岁(35～76岁)。其中结肠癌14例，直肠癌6例；组织学类型分为：腺癌10例，粘液腺癌6例，印戒细胞癌4例；对肿瘤病理组织做出细胞学分级的诊断(Dukes．分期)为A期5例，B期6例，C期6例，D期3例。术前未经化疗、放疗或免疫治疗。在手术中采集癌组织及癌旁组织标本(距肿瘤边缘5cm处)一部分立即置于液氮罐中，后转移至-80℃低温冰箱中保存用于实验，另一部分用10％甲醛固定，用于病理诊断。

　　1．2  方法

　　1．2．1  主要试剂

　　RNA提取及RT-PCR检测试剂盒购自华美生物工程公司，端粒酶定量检测试剂盒(BoehringerMannheim)购自Roche公司。

　　1.2．2  RT-PCR检测 

　　Survivin基因表达(1)组织RNA提取：取组织50～100mg切成薄片，用冷PBS缓冲液洗涤后,加TrizolTM溶液在玻璃匀浆器中充分匀浆，参照试剂盒说明书行一步法提取总RNA。紫外分光光度计于260nm和280nm测吸光度值，且A260／A280≥1．8。(2)RT-PCR反应：反应体系加入4μg RNA,0．5μg Oligo(dT),20U RNasin,200U M-MLV逆转录酶缓冲液，反应终体积为25μl。反应混合液在42℃保温1h，最后95℃ 5min灭活 M-MLV逆转录酶活性，冰上冷却后完成cDNA合成。为保证mRNA提取和逆转录效应的可信性，以3磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)表达作为内参照，其PCR条件与下述所描述的条件一致。Survivin基因引物序列：正向引物 5’-GGAC-CACCGCATCTCTACAT-3’(位于外显子-1的2855-2984);反向引物5’-GCACTTTGCCAGTTTCC-3，(位于外显子-4的11990-12009)，扩增产物为338bp。G3PDH基因引物序列上游序列5'-CCA CCCATG-GCA AA TTCCATGGCA-3，(212-236)，下游序列5'-TCTAGACGGCAGGTCAGG TCAGGTCCACC-3'(787～811)。在25μl反应体系中，含上下游引物各20p mol,cD-NA 2μg，Taq DNA聚合酶1U,4种dNTP各0.2mmol／L及PCR缓冲液。PCR参数为95℃ 1min，55℃ 1min,72℃ 1min,共31个循环。(3)电泳：PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)显色，紫外线灯下观察 338bp survivin特异扩增条带及599bp G3PDH内参照扩增片断，只出现599 bp片断为阴性。

　　1．3  统计学处理计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。

　　2 结果

　　2．1 Survivin在大肠癌和癌旁组织的表达 

　　20例大肠癌和癌旁组织 Survivin mRNA表达的阳性率分别为65．0％(13／20)和25．0％(2／20)，两者差别有统计学意义(χ2=6．664，P<0．01)。

　　2．2 Survivin表达和端粒酶相对活性(RTA)与大肠癌临床病理学特征的关系大肠癌组织中Survivin基因表达与肿瘤大小、侵袭深度、分化程度及是否有淋巴结转移无关(P>0．05),见表2。表2  Survivin表达与大肠癌临床病理学特征的关系项目水平例数Survivin（略）

　　3 讨论

    生存素是1997年Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体 21(EPR21)cDNA从人类基因组库中杂交筛选克隆出来的，基因全长15kb，位于17q25,含有4个外显子和3个内含子，基因编码产生一含142个氨基酸的蛋白，是目前人类IAPs家族中研究最多的一个基因。生存素结构独特，不同于其它IAP家族成员，仅含有一个杆状病毒LAP重复序列(BIR)，没有环指结构。生存素在胚胎和胸腺组织中丰富表达，在人类大多数肿瘤亦存在高表达(美国国立癌症研究所用于抗癌药物筛选的60株肿瘤细胞中均存在生存素高表达)。Survivin的主要生理功参与增殖细胞的生长、分化，促进胚胎细胞的分和增殖，大多数研究均认为生存素除了在胚胎发育过程中和绝大多数肿瘤组织中表达外，在正常组织中不表达，近年研究检测结果发现，除了睾丸、甲状腺、胎盘外,survivin尚在成人正常的子宫内膜、肾上腺髓质和大肠黏膜中有部分表达或低表达。相反，在多种恶性肿瘤中 Survivin前检测组织中survivin表达的方法有RT-PCR法、原位杂交法、免疫组化法及Western blot法，但由于报道较少还未能作出方法学的确切评价。 RT-PCR方法灵敏性和特异性好，因为方法中涉及到PCR扩增和特异引物的使用，少量细胞甚至单个细胞即可完成实验。本文采用RT-PCR法观察了大肠癌及其癌旁组织survivin mRNA的表达与其临床病理学的关系，研究发现survivin表达与肿瘤大小、侵袭深度、分化程度及淋巴结转移无明显关系(P>0．05)。本研究采用较为敏感的RT-PCR方法检测大肠癌及癌旁正常组织中生存素mRNA的表达，结果大肠癌组织中阳性表达率(65．0％)明显高于癌旁正常组织(25．0％)，这与Sarela等［3］的研究结果一致，表明生存素是一个较为特异的肿瘤标志物。生存素mRNA的表达与大肠癌临床病理参数，这与徐晓的研究一致［4］，而一些研究在大肠癌肝转移患者中发现生存素mRNA的表达明显低于无转移者［5］；在子宫内膜癌的研究中，有学者认为［6］，生存素蛋白的表达与子宫内膜癌的临床分期，组织分化及浸润深度有关。Kawasaki等［7］提出survivin表达上调预示着生命期缩短和预后不良，生存素mRNA的表达与肿瘤患者的预后相关，这已在非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌中得到证实。在大肠癌的研究中,Serela等的研究表明在Ⅱ期大肠癌中生存素mR-NA阴性表达组患者的5年生存率(94．4％)远高于阳性表达组(44．8％)，提示Ⅱ期大肠癌术后检测生存素mRNA或生存素蛋白可作为评价大肠癌预后的客观指标。近来，一些体内、外试验研究表明［8］，在生存素阳性表达的细胞株或患者中，对化疗或放疗抵抗现象 (Chemo-radioresistance)普遍，而封闭生存素的表达则会增加肿瘤对放、化疗的敏感性。因此，从临床角度讲，生存素阳性表达的肿瘤患者其治疗效果可能不佳，化疗耐药现象可能和一些凋亡抑制基因如生存素有关，针对靶基因生存素的基因治疗可望改善临床治疗效果。

【参考文献】
  　　［1］Kawasaki H, Toyoda M, Shinohara H, et al. Expression of survivin correlates with apoptosis, proliferation, and angiogenes is during human colorectal tumorigenesis［J］.Cancer, 2001,91 (11):2026～2032.

　　［2］Chakravarti A, Noll E, Black PM, et al. Ouantitatively determined survivm expression level are prognostic value in human gliomas［J］. Clin Oncol,2002,20(4):1063～1068.

　　［3］Sarela AI, Macadam RC,Farmery SM,et al.Expression of the antiapoptosis gene, survivn,predicts death from recurrent colorectal carcinoma［J］.Gut,2000,46(15):645～650.

　　［4］徐晓,陈卫昌,刘强,等.生存素在大肠癌中的表达及其与血管生成的关系［J］.江苏医药,2005,31 (6):439～442.

　　［5］Sarels Al, Verbeke CS, Ramsdale J,et al. Expression of survivin, a novel inhibitor or apoptosis and cell cycle regulatory protein in pancreatic adenocarcmoma［J］.Br J Cancer, 2002,86(6):886～892.

　　［6］Tanaka K, lwamoto S,Gon G,et al. Expression of survivm and its relationship to loss of apoptosis in breast careinomas［J］.Clin Cancer Res,2000,6(2):127～134.

　　［7］Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD,et al. Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer［J］.Cancer Res, 1998, 58(22):5071～5074.

　　［8］Asanuma K,Moriai R, Yajima T, et al. Survivin as a radioresistance factor in pancreatic cancer［J］. Cancer Res,2002,91(12):1204～1209.