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【摘要】 目的 探讨乙肝病毒全基因组瞬时转染HepG2细胞后，对HBV抗原分泌，病原识别受体Toll样受体2、4(TLR2、4)的表达及细胞增殖的影响。方法 已构建pBlueScript -HBV质粒并经测序，转化宿主菌，摇菌后提取质粒，用Sapl酶切，获得HBV 3．2kb基因组，采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2，IMX检测HBV所分泌抗原，台盼蓝计数检测细胞增殖活性，直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测TLR2、4在细胞株上表达的阳性细胞率，并与空白对照绗对比。结果 HBsAg利HBeAg的分泌随着转染HBV DNA量的增加而升高，除4μg和6μg组两组间比较的表面抗原外，差异均有显著性意义(P<0．05)。TLR2、 4在转染后均有上调，TLR4在各组间差异显著(P<0．05)，但TLR2只在最大剂量转染组时差异有显著性(P<0．05)。台盼蓝拒染法示细胞存活随转染剂量的升高而减少(P<0．05)，但 4μg和6μg两组间比较无显著意义(P>0．05)。而各转染剂量组HBsAg和e抗原的分泌及细胞的存活数均与TLR2、4的表达呈显著正相关(P<0．01)。结论 研究结果初步表明乙肝病毒可能直接引起HepG2细胞TLR2、4的上调，而且TLR的上调可能启动了细胞的凋亡或坏死机制，成为HBV损伤细胞的非免疫细胞介导机制。
【关键词】 乙型肝炎病毒; Toll样受体2、4; HepG2细胞株
Expression of TLR2 and TLR4 of HepG2 strain transfected in hepatits B virus.
LI Yong-wei, GUO Yun-wei, ZHU Ming-fen, et al.
The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong, P. R. China
Abstract：Objective To investigate the expression of Toil-like rectors of 2,4(TLR2,4) on HepG2 cells after tranfection with hepatitis B virus genome, also including secretion of HBV antigen and proliferation of cells. Methods To crate pBluScript-HBVplasmid, sequencing, trandform bacteria, extract plasmid, and cut with enzyme Sap 1, obtain 3.2kb genome, and trand-ct HeG2 cells with lipo-etamine 2000, IMX examine HBsAg, HBeAg and Trypan blue staining examine the sum of living cells. FCM examine the present of positive cells percent ecpressing TLR2 and TLR4 in contrast to the normal group. Results HbsAg and HbeAg expression increased significantly with the transfection dosage excluding the expresion of HbsAge in 4μg and 6μg. The intensity of TLR4 expression in HepG2 cells was significantly higher than that of the contrl group (P<0.0%), but TLR2 was higher significantly in the 8μg group. The sum of living cells reduced with the increasing of transfection dosage. The expression of HBsAg and HbeAge and the the living cells were notably positive correlated with the intensity of TLR2,4. Conclusion HBV may result in the dirtect expression of TLR2,4, it may make cell apoptosis or necrosis directly, which may be not dependent on immune hurt.
Key words：Heptitis B virus; TLR2, TLR4; HepG2 cell
免疫介导的肝损伤是慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)发病的主要机制，近年来先天免疫中的TLR(toll like receptor)信号家族与病毒性肝炎的关系成为该领域研究的新热点，Masanori等认为肝细胞不表达TLR，HBV本身也不能激活TLR,TLR的抗病毒作用是由免疫细胞介导的，认为HBV可能还没有进化出针对TLR信号通路所诱导的抗病毒效应的对策［1］。然而也有证据表明在免疫低下的慢乙肝患者，可出现TLR的表达并直接导致肝损伤［2］，但并未能排除体内其它因素对TLR的影响。因此在体外以HBV为唯一干预因素作用于HBV研究常用的细胞模型HepG2细胞株，可较直接地研究病毒对TLR的影响。本文采用体外扩增HBV全长基因组转染HepG2细胞株，初步观察了转染细胞HBV表面抗原、e抗原的分泌，TLR2、TLR4的表达、细胞的增殖活性及三者之间的关系。
1 材料与方法
1．1 主要试剂
血清HBV DNA提取试剂盒(QIAamp Blood Mini Kit)及胶回收试剂盒(Qiaqulck Gel ExtractionKit)购自德国Qiagen公司;无内毒素质粒中量提取试剂盒购自Omega公司;Sap I限制性内切酶购自NEB公司;HBsAg、HBeAg ELASA试剂盒购自中山生物工程公司; Opti-MED、DMEM购自Gibco公司;Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogeng公司，TLR2、4抗体购自eBioscience公司；台盼蓝购自Sigma公司;HepG2细胞株由本院肝移植科张彤博士惠赠。其他试剂来自于广东省肝脏疾病研究重点实验室。
1．2 扩增提取质粒
PBlueScipt-HBV全基因组质粒由本课题组构建保存，经测序为B基因型／adw2血清型［3,4］，取200μl菌液置于30～50ml LB培养液，37℃ 1恒温摇床300转，摇菌16h后用Omega无内毒素中量提取试剂盒提取质粒，约40ml菌液离心去上清，加入溶液I／RNAse 3ml充分震荡混匀；加入溶液Ⅱ 3ml，轻柔混匀7～10次，溶液变澄清，静止3～5min；加2.1ml冰浴后 Neutralization Buffer,轻柔混匀,静止2～3min;15 000g,4℃离心10min;加0.1倍体积的ETR solution，混匀冰浴10min：再42℃温浴5min，离心3 000～5 000g 5min，含有大量内毒素的蓝色ETR沉于底部;转移上消到15ml离心管，加0．5倍体积的无水乙醇混匀静止2min；加上述溶液至DNA吸附柱，室温离心2 000～5 000g 2min，弃下液，至溶液过柱完毕;加3．5ml Buffer HB到柱中同前离心，弃下液;加3．5ml SPW wash buffer入柱中离心，共两次；离心空柱10min，8 000g以下;进一步干燥离心柱;将柱子转移到新的15ml离心管，加1ml预热70℃的Endotoxin-free Elution Buffer，静止2min后，8 000g离心2min，核酸蛋白仪测DNA浓度及OD260／OD280。
1．3 质粒的酶切及胶回收纯化
SapI酶切所提取质粒，酶切体系：10×NEB Buffer 5μl、DNA 2μg、内切酶4U，灭菌双蒸水加至50μl，37℃水浴14h。产物用1％琼脂糖电泳后，切下3．2kb条带的胶，用EP管称重，加入QG Buffer比例为3体积QG Buffer：1体积的胶(如300μl QG Buffer： 100mg胶)；50℃孵育10min，使之完全溶化并混匀，将溶液加入离心柱，每次加700μl， 10 000g离心1min，弃下液，再加入溶胶液，至过柱完毕；加500μl QG Buffer离心1min，弃下液；加750μl Buffer PE入柱中离心1min，弃下液；离心空柱1min；加柱子放入新的 EP管，加50μl Buffer EB到柱中心膜上，静止1min，离心1min，收集下液，测DNA浓度后保存于-20℃备用。
1．4 细胞培养及实验分组
HepG2细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中于37℃、饱和湿度、5％ CO2的细胞培养箱中培养，培养液中含100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素，转染前24h细胞铺于六孔板，第2d细胞密度达95％以上转染，按转染剂量分为8μg组，6μg组，4μg组，空白对照组除无HBV DNA外，其余均与实验组相同，每组3个复孔，分3次独立实验完成。
1．5 Lipofectamine2000转染HepG2细胞
转染前去除原培养液，PBS洗两次，每孔加2ml Opti-MED培养液，HBV DNA与脂质体比例为8μg：20μl、6μg；15μl、4μg；10μl，分别加500μl、300μl、250μl Opti-MED轻柔混匀后室温孵育5min，再混合两者，同上孵育20min后，加入六孔板，前后摇匀，置培养箱培养，4～5h后加入含20％胎牛血清的DMEM，使血消终浓度至10％，转染后24h弃上清，PBS洗两次，再更换含10％胎牛血清的DMEM，转染后48h收集细胞，采用IMX法检测培养上消中HBsAg、HBeAg的含量。
1．6 细胞增殖活性的测定
HBV转染细胞后48h，用0．25％胰蛋白酶消化收集细胞，重悬于PBS溶液中，按1：1加入0．4％台盼蓝染色，光学显微镜下计数染色阴性细胞(活细胞)。
1．7 直接免疫荧光流式细胞术(FCU)检测TLR2、TLR4表达
转染后48h收集细胞，消化细胞，加DMEM培养基离心3～5min／1 000rpm，去掉培养基，500μl PBS重悬细胞，取100μl细悬液，分别加TLR2、4标记抗体各10μl，混匀，避光孵育20～30min，加PBS 2ml，离心2 000rpm／5min，弃上清，加Iml PBS重悬上机，同型对照加无关抗体消去本底。
1．8 统计学分析
实验结果用平均数±标准差表示，采用SPSS13．0统计软件对数据进行单因素方差分析，并进行相关分析，P<0．05差异有显著性意义。
2 结果
2．1 pBluScript-HBV酶切及胶回收后电泳
SapⅠ酶切质粒后电泳，采用1%琼脂糖电泳，可见质粒被切为3．2kb的HBV DNA，约2．8 kb的pBlueScript载体部分；切下有3．2kb目的条带的胶，采用Qiagenquick Gel extraction kit胶回收后再电泳，只见3．2kb的HBV DNA，两图中右侧均为Marker，见图1～2。
2．2 不同剂量HBV转染各组细胞培养上清HBsAg、HBeAg表达
HBV转染后48h收集所培养细胞上清，各转染剂量组间HBsAg、HBeAg数值总体均数间的差别有统计学意义(HBsAg：F=54．152，P=0．000；HBeAg：F=85．065，P=0．000)表明随着感染 HBV量的增加，细胞表面抗原和e抗原的分泌也明显增加，除4μg和6μg两组间比较的表面抗原外，差异均有统计学意义(P<0．05)，见表1。Table 1 Expression of HBsAg, HBeAg in the three groups(略)
2．3 HBV转染各组及空白对照组TLR2、4阳性细胞率的表达
转染后48h流式细胞仪检测TLR2、4阳性细胞率的表达，各转染剂量组间及空白组TLR2、 TLR4数值总体均数间的差别有统计学意义(TLR2：F=14．438，P=0．001；TLR4：F=59．439，P=0．000)。各剂量组与空白对照组的比较显示TLR4的表达显著上调(P<0．05)，各剂量组间比较差异有显著意义(P<0.05)，即随着感染HBV量的增加，表达TLR4的阳性细胞率也增多； TLR2的上调在8μg组与其它组间的比较及6μg组与空白对照组的比较均有显著性差异(P<0．05)，4μg组与空白对照组间、4μg与6μg组间比较差别均无显著意义(P>0.05)，见表2。Table 2 Expression of TLR2,TLR4 in the four groupsHBV DNA(略)
2.4 HBV转染各组及空白对照组台盼蓝染色活细胞数
采用台盼蓝拒染法计数转染HBV DNA后存活细胞，各组均数±标准差为(单位1×106)；4μg组为3.1±0.18；6μg组为2.9±0.20；8μg组为1．5±0．08；空白对照组为3．8±0．12，各剂量组总体均数间差异有统计学意义(F=35．952，P=0．000)，其中空白对照组与各组间比较均P<0．05：4μg组与6μg组比较显示P>0．05；8μg组分别与6μg、4μg组间比较示P<0．01，表明细胞转染HBV DNA后随着转染剂量的增加，细胞死亡也增多，HBV可能触发了细胞的坏死或凋亡机制。
2.5 TLR2、4水平与HBV抗原及存活细胞数的关系
转染后细胞TLR2、TLR4表达与HBV分泌的HBsAg、HBeAg、台盼蓝染色活细胞数的相关性分析。结果显示，TLR2、TLR4表达均与HBsAg、HBeAg、台盼蓝染色活细胞数呈显著正相关(P≤0.01)，见表3。Table 3 Relation between TLR2, TLR4 and HBV antigen, the sum of living （略）
3 讨论
HBV全基因组体外扩增及转染肝癌细胞系的方法始于1995年的STEPHANGU·NTHER［5］，为研究HBV提供了较好的方法，但由于HBV的特殊结构，全长基因的克隆及磷酸钙的低转染率仍然是阻碍研究的难题，随着分子生物学技术的发展，高效DNA聚合酶及脂质体转染试剂的开发，尤其是各种纯化方法的改进为研究HBV对细胞的影响提供了方便，使结果更为可信。采用无内毒素中量提取质粒的方法，获得pBlueScript-HBV质粒，酶切后纯化目的条带，HBV在脂质体的介导下转染HepG2细胞，避免载体及可能存在的细菌基因组对TLR表达的干扰，可较好的观察是否HBV直按HepG2细胞TLR的表达水平产生影响。
TLR为Ⅰ型跨膜蛋白，它们参与机体免疫反应，可起到抗病毒作用［6］。免疫介导的肝揭伤是多种慢性肝病发病的主要机制，近来的研究显示，TLRs信号系统可能在肝脏疾病包括丙型病毒(HCV)性肝炎的发生及免疫介导的肝细胞损伤中起重要作用，如HCV的蛋白成分可直接作用于TLR家族的信号分子，导致HCV持续感染，表现了病毒免疫逃避的独特机理［7］。至于TLR与乙型病毒性肝炎也有初步研究，HBV的核心抗原可促使人类的THP-1巨噬细胞分泌细胞因子，这一作用依赖于TLR2介导的核转录因子的激活［8］。体内外实验表明e抗原(HBeAg)阳性可促使TLR2明显下调，并同时出现相关细胞因子的减少［9,10］。因此 TLR2的下调可能是HBV持续感染的机理之一。本实验结果发现TLR2在8μg组及6μg组明显上调，e抗原的分泌与TLR2呈显著正相关，与上述报道不同。但本课题的其他实验发现在HBV稳定表达只分泌e抗原的HepG2．2．15细胞株中，TLR2明显下调，因此一方面考虑TLR2的表达在急慢性HBV感染细胞株可能是不一样的，即TLR2在HBeAg阳性的急性感染者有可能高于慢性感染者。另外文献中所用的载体也可能对TLR表达有一定影响。如 Li-Rung Huang等人曾构建以腺相关病毒(AAV)为载体的HBV全基因组感染小鼠，证实AAV可促进HBV的持续感染状态［11］。TLR4的表达在各组问及与空白组的比较显示也有显著上调，即随着感染HBV量的增加，TLR4的表达也上升。
本研究初步表明随着转染HBV量的增加,表面抗原和e抗原的分泌明显增加，除4μg和6μg两组间比较的表面抗原外，差异均有统计学意义。台盼蓝染色阳性细胞数显示随着转染HBV量的增加，存活的HepG2细胞也随之减少，光镜下观察细胞形态欠佳。各转染量组HBsAg和e抗原的分泌及细胞的存活数分别与TLR2、4的表达呈显著正相关，表明HBV可能直接导致TLR2、4在HepG2细胞株上调，细胞出现坏死或凋亡，这一损伤不是由免疫细胞介导的，很可能是由TLR直接上调所致。由于目前体外研究HBV一直采用肝癌细胞株，但并不能因此结果得出HBV可以治疗肝癌的结论。本结果表明类似于人体急性HBV感染的HBV瞬时转染导致了癌细胞死亡，这一现象可能与人体以部分感染细胞死亡的代价来终结HBV感染一样。就免疫成熟个体的HBV感染来说，急性感染的恢复者约95％，但是HBV为了持续感染(如上述HCV)，可以通过HBeAg这一耐受因子来下调TLR2(HepG2．2.15细胞株)。因此说明TLR信号分子可能参与了HBV急慢性感染的发病机理，成为HBV所致免疫发病机理的的重要分子。
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