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【摘要】 目的 对某中药制剂中掺加物盐酸普罗帕酮进行分离鉴定，并对其进行含量测定。 方法 用柱层析法分离纯化掺加物盐酸普罗帕酮，用化学方法、色谱法及光谱法进行鉴定，采用高效液相色谱法确定其掺加量。该液相色谱法采用ApolloC18色谱柱，以甲醇-0.01mol·L-1磷酸氢二氨溶液(3:1)为流动相，流速1.0ml·min-1，检测波长248nm。 结果 该中药制剂中含有盐酸普罗帕酮成分，每g含盐酸普罗帕酮4mg。 结论 用化学方法、色谱法及其光谱法多种方法确证了该中药制剂中掺加了盐酸普罗帕酮，用高效液相色谱法确认其含量，亦为药品打假提供有益思路及方法上的借鉴。
【关键词】 中药制剂 掺加物 盐酸普罗帕酮 鉴定 含量测定
质量标准的提高，将会使得市场监督特别是伪药、假药的识别和判断依据更可靠。现今出现的高科技造假现象，我们更需要专属更强的分析手段。鉴于上述情况，特别是面对复杂的中药中加入西药成分，如何准确、快速进行分析是我们的当务之急。
口服抗心律失常药对心律失常病的治疗占有重要的地位，除化学合成抗心律失常药外，患者对中药制剂和保健品有一种天然信任，假药生产商利用患者这一心理，乘机在中药制剂中非法添加化学合成药物，夸大疗效宣传，高价推销牟取暴利。而普通消费者不具备识别能力，从而在不知情的情况下长期服用违禁添加的化学合成药，导致诸多药品不良反应的发生。
某抗心律失常的纯中药制剂，其主要成分为党参、黄精、三七、琥珀及甘松。今发现该药中掺加了盐酸普罗帕酮成分。本文建立了中药制剂中违禁添加物盐酸普罗帕酮的定性、定量分析方法［1,2］，亦为药品打假提供有益思路及方法上的借鉴。
1 试药与试剂
被检药物：某中药制剂，处方组成为党参、黄精、三七、琥珀、甘松。盐酸普罗帕酮（Propafenonehydrochloride）纯度为99.3%，安阳益康制药厂提供。
2 实验方法与结果
2.1 鉴定
2.1.1 化学鉴别反应 该中药制剂用水提取后，过滤得澄清溶液，加AgNO3试液数滴，有白色沉淀，分离，沉淀加氨试液即溶解，再加稀硝酸后，沉淀复生成，显Cl-1反应。
2.1.2 TLC法鉴别 (1)仪器及试剂：ZF-C型三用紫外分析仪(上海康禾光电仪器有限公司)，氯仿(AR)，甲醇(AR)，醋酸乙酯(AR)，氨水(AR)，硅胶(GF254薄层层析用硅胶)。(2)供试品溶液制备：取某中药制剂一包，加100ml 5%氢氧化钠溶液，超声10min，转移至分液漏斗中，用20ml氯仿提取，分取下层有机相，作为供试品溶液。(3)对照品溶液制备：取盐酸普罗帕酮20mg，同上法制备。(4)色谱条件：硅胶GF254薄层板，展开剂为醋酸乙酯—甲醇—氨水(85:10:5)。(5)实验方法：供试品溶液和对照品溶液，各点样20μl，用上述展开剂上行法展开，取出晾干。在254nm紫外灯下检测。(6)结果：在254nm紫外灯下检测，样品与对照品展开后在同一位置都有红褐色斑点，证明该中药制剂中含有盐酸普罗帕酮成分。
2.1.3 HPLC法鉴别 (1)色谱条件同含量测定，典型色谱如图1。(2) 结果：在此色谱系统下，某中药制剂供试液与盐酸普罗帕酮对照液在同一保留时间均有主峰出现，HPLC证明该中药制剂中含有盐酸普罗帕酮成分。
2.1.4 光谱法鉴定 (1)样品提取：取某中药制剂3包，加5％氢氧化钠溶液50ml，超声10min，转移至分液漏斗中，用20ml氯仿提取，取下层有机相，置于锥形瓶中，在水浴箱中挥发掉部分氯仿后，用柱色谱法进一步分离纯化。(2)柱色谱纯化：将柱色谱用硅胶与展开剂醋酸乙酯—甲醇—氨水(85：10：5)混匀后湿法装柱。将上述经提取的样品用适量硅胶混匀，填入柱上端，缓缓加入展开剂，用小瓶分瓶收集，并用薄层色谱法监控，将含有盐酸普罗帕酮成分的合并于圆底烧瓶中，用旋转蒸发至留少量液体，置于离心管中，用5％盐酸溶液调pH为4，放置冰箱中，过夜，有白色晶状沉淀析出。滤出沉淀后于红外灯箱内烘干。将得到的晶状物再同法用柱色谱法2次分离纯化，得到白色沉淀，HPLC测其纯度>99.5％，供光谱鉴定用。
图1 典型HPLC图（略）
Fig 1 Tipical HPLC chromatogram
质谱分析：①条件：Agilent ll00 LC-MS仪；电喷雾离子化，电压70V；供试品与对照品均用甲醇溶解。②结果：从质谱图可见，供试品的质谱图中m/z 342和m/z 364分别为［M+H］+和［M+Na］+峰，与普罗帕酮的分子离子峰一致。同时供试品和对照品的质谱图一致。
紫外吸收光谱：①条件：PE Lambda2 UV/Vis仪，供试品与对照品均用水配成约100μg·ml-1溶液。②结果：由紫外吸收光谱图显示，供试品在304.8，249.6，208.7nlil处有最大吸收，与普罗帕酮的分子结构中有苯环和酮羰基发色基团相符。同时供试品和对照品的紫外吸收光谱谱图一致。
核磁共振氢谱：①条件：BrukerAV-500核磁共振仪；DMSO-d6为溶媒。②结果：由核磁共振氢谱谱图表明，供试品从高场到低场共有13组峰，峰面积积分相当于25个氢，分子结构中有27个氢，少两个氢是由于羟基和仲氨基的两个活泼氢已被氘代。高场区(δ<5)有8组峰，峰面积积分相当于16个氢。其中80.87为三重峰，峰面积积分相当于3个氢，归属为甲基氢；δ1.62为多重峰，峰面积积分相当于2个氢，归属为与甲基相连的亚甲基氢；δ2.48～3.32，峰面积积分相当于8个氢，归属为分别与氨基，酮羰基和苯环相连的4个亚甲基氢；δ4.11为二重峰，峰面积积分相当于2个氢，归属为与氧相连的一个亚甲基氢；δ4.27为三重峰，峰面积积分相当于1个氢，归属为与羟基相连的次甲基氢。低场区(δ>5)，δ7.02～7.51峰面积积分相当于9个氢，归属为两个苯环上的氢。氢数和化学位移与普罗帕酮的分子结构一致，同时供试品和对照品的核磁共振氢谱谱图一致。
红外吸收光谱：①条件：NICOLET inpact410红外仪；KBr压片。②结果：由红外光谱图可见，>3 000cm-1为苯环不饱和碳氢的伸缩振动，1 659cm-1为酮羰基的吸收，他比通常的酮羰基吸收低，是因为和苯环共轭，使振动频率降低。1 594cm-1和1 451cm-1为苯环骨架振动，1 300cm-1和1 240cm-1为碳氧伸缩振动。这与普罗帕酮的分子结构一致，同时供试品和对照品的红外吸收光谱谱图一致。
2.1.5 结果分析 供试品与盐酸普罗帕酮对照品的IR，LTV，1H-NMR，MS谱一致，表明某中药制剂中含有盐酸普罗帕酮成分。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.01mol·L-1磷酸氢二氨溶液(3:1)为流动相；流速为1.0ml·min-1；检测波长为248nm。理论板数按盐酸普罗帕酮色谱峰计算，应不低于3 000。
2.2.2 专属性试验 取盐酸普罗帕酮适量3份，分别经强酸(5%HCl)加热(～100℃)、强碱(5%NaOH)加热(～100℃)和双氧水加热(～100℃)破坏处理，然后用流动相溶解稀释后进行HPLC分离分析。结果表明,在本色谱条件下，盐酸普罗帕酮色谱峰不受降解产物的干扰。
2.2.3 线性测定 取盐酸普罗帕酮25mg，精密称定，置于25ml量瓶中，流动相稀释至刻度，作为对照品储备液，分别吸取储备液5.0、2.5、1.0、0.5、0.25于10ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度，分别量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，进行线性回归，结果表明在0.025～0.5mg·ml-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为：A=7.1095×103+107C，r=0.9999。
2.2.4 进样精密度试验 取“2.2.3”项下0.1mg·ml-1的对照品溶液连续进样，测定峰面积，RSD为2%。
2.2.5 回收率试验 取某中药制剂1g，精密称定，精密加入30ml流动相，密封，于水浴上加热使其溶解完全，作为供试液。另取盐酸普罗帕酮10mg，精密称定，置10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，作为储备液，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，作为对照液。分别精密吸取以上供试液5ml于3个10ml量瓶中，同时精密吸取以上储备液0.7、0.5、0.3ml分别于以上3个量瓶中，流动相稀释至刻度，得高，中，低回收率供试液，吸取以上各供试液和对照液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1。
表1 回收率试验结果（略）
2.2.6 含量测定 取某中药制剂0.5g，精密称定，精密加入20ml流动相，密封，于水浴上加热使其溶解完全，吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。另盐酸普罗帕酮10mg，精密称定，置10ml量瓶中，流动相稀释置刻度，再精密吸取1 mL至10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，同法测定。结果见表2。
表2 含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 中药制剂中成分复杂，目前对于中药制剂中违禁添加化学合成药物一般采用HPLC-UV法［3］和LC-MS法［4,5］进行定性。利用HPLC保留时间进行鉴别，有一定的局限性。LC-MS法通过保留时间和一级、二级质谱定性，定性准确性远远大于HPLC法，但由于中药成分的复杂性，依然存在有干扰的可能。
3.2 质谱、紫外、红外和核磁共振四大光谱在鉴定方面具有无可比拟的优势，本文建立了某中药制剂中盐酸普罗帕酮的分离纯化方法，并通过四大光谱法进行了鉴定，能够得出明确的结论，即该中药制剂中添加了盐酸普罗帕酮。同时建立了添加物盐酸普罗帕酮的含量测定方法，该方法准确度高，加样回收率为100.2%，测得该中药制剂中每克含有约4mg盐酸普罗帕酮。
【参考文献】
［1］ 中华人民共和国药典委员会.2005年版中华人民共和国药典二部［S］. 北京：化学工业出版社,577.
［2］ 邵红，汪洁. 盐酸普罗帕酮片及注射液的HPLC测定［J］. 中国医药工业杂志，2001, 32(10): 463.
［3］ 曾茂法、张学斌. 高效液相色谱法同时鉴别保健品中非法添加的四种降糖药成分［J］. 中国现代应用药学杂志, 2006, 23(6): 506.
［4］ 李晓东, 王瑾, 张雅军. 液质连用检测中药保健品中参加降糖化学药的方法研究［J］. 分析测试学报, 2005, 24(6):41.
［5］ 张喆, 高青, 余倩, 等. 中药制剂及保健品中违禁添加9种化学降糖药的 HPLC-MS/MS定性检测［J］. 中国医药工业杂志, 2007, 38(1): 39.
作者单位：海南省药品检验所，海南 海口 570216； 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 210009