紫草素对肝癌细胞增殖的影响

【摘要】  目的 研究紫草素对肝癌细胞株HepG2增殖和表达增殖诱导配体（A proliferation-inducing ligand，APRIL）水平的影响,并与化疗药顺铂进行对比。 方法 MTT法检测紫草素对HepG2细胞增殖的抑制作用，采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法证实肝癌细胞株HepG2上APRIL的表达，实时荧光定量PCR法检测加入不同终浓度的紫草素和顺铂后24h、48h和72h HepG2细胞表达APRIL mRNA的水平。 结果 紫草素对HepG2细胞有明显的增殖抑制作用，呈时间和剂量依赖性，HepG2细胞上有APRIL的表达，加入不同浓度的紫草素和顺铂后，HepG2细胞APRIL mRNA的水平均逐渐升高，至72h表达最高并与空白对照相比均有显著差异（P<0.05）。 结论 紫草素可抑制肝癌细胞的增殖，但与顺铂一样，残存癌细胞有因APRIL表达升高而增殖能力增强的潜在趋势。

【关键词】  紫草素 APRIL 肝肿瘤 实时荧光定量PCR

近年的研究显示紫草素及其衍生物有一定的抗肿瘤效应而没有化疗药物的副作用［1］,因其还可用于乙型病毒性肝炎的治疗，而我国的原发性肝癌多发生于慢性乙型病毒性肝炎和肝硬化，故研究紫草素在原发性肝癌中的作用及机理存在问题有一定的意义。增殖诱导配体（A proliferation-inducing ligand，APRIL），是肿瘤坏死因子超家族新成员，有重要的促进肿瘤生成和增殖的能力［2］。我们通过研究紫草素对肝癌细胞株HepG2增殖和表达APRIL水平的影响，从另一侧面对紫草素及APRIL的抗癌研究提出新的问题。

　　1  材料和方法

　　1.1  细胞株  肝癌细胞株HepG2为中山大学附属第三医院传染科实验室保存。

　　1.2  主要试剂及仪器  紫草素(BIOMOL公司)，顺铂(德州德药制药有限公司)，DMEM、新生牛血清（GIBCO公司），MTT：3-(4，5-甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（上海生工），Trizol试剂（Invitrogen公司）,实时荧光定量RT-PCR试剂盒SuperScriptTM III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit（Takara生物技术有限公司），ABI 7000 Rael Time PCR扩增仪（ABI公司）。

　　1.3  肝癌细胞株HepG2上APRIL的表达  细胞培养液为含10%灭活新生牛血清的DMEM培养基，常规培养肝癌细胞株HepG2并传代。将HepG2细胞以1×105/ml接种于放有盖玻片的6孔板中，培养48h后用冷纯丙酮固定，采用SABC免疫组化法染色，具体步骤参照试剂盒推荐步骤进行，阳性染色为棕色细颗粒状，阳性细胞在5%以上定为阳性；另采用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时一步逆转录-PCR反应以检测HepG2细胞APRIL的mRNA水平（方法见1.7）。

　　1.4  紫草素与顺铂对HepG2细胞增殖的影响  采用MTT法，取对数生长状态良好的HepG2细胞以1×104/ml接种于96孔板，每孔加入200μl细胞悬液，预培养12h，随后加入终浓度分别为0.029、0.288、2.88、5.76μg/ml的紫草素，及终浓度分别为2.5、5、10、20μg/ml的顺铂，每组设4个复孔，另设空白对照孔和阴性对照孔。于作用24、48、72h时，每孔分别加入5g/L MTT 20μl，37℃孵育4h，弃上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，微振荡10min。应用POLARstar OPTIMA 多功能微板测试系统，于波长490 nm 处测得每孔的吸光度(A)，重复测量3次。计算细胞生长抑制率(%)=［1-(A药物组-A空白对照组)／(A阴性对照组-A空白对照组)］× 100，用抑制率对2种药物作用浓度对数做图，根据曲线方程求出各作用时间的半数有效抑制浓度（IC50）。

　　1.5  紫草素和顺铂对HepG2细胞表达APRIL mRNA水平的影响  取对数生长状态良好的HepG2细胞以104/ml接种于6孔板，预培养24h，随后加入终浓度分别为0.029、0.288、2.88μg/ml的紫草素和终浓度分别为5、10、20μg/L的顺铂，每组设3个复孔，另设空白对照孔不加任何药物。于作用24、48、72h时，Trizol消化收集细胞提取总RNA进行实时一步逆转录-PCR反应（方法见1.7）。

　　1.6  引物设计合成和标准曲线的构建  两对引物APRIL（5′-AAGGGTATCCCTGGCA GAGTC-3′，5′- GCGTTAATGGGAACCAGGTG-3′，148bp）；内参照β-actin（5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，186bp），由Takara生物技术有限公司设计并合成。取中山大学附属第三医院传染科实验室建立并保存的pbluescript-HBV质粒，核酸蛋白紫外分析仪核酸定量，1：10倍比稀释作为标准品，与待测样本同时进行荧光定量PCR反应，以其Ct(域值循环数，threshold cycle)值与不同浓度标准品的对数值拟合作图，建立标准曲线。

　　1.7  HepG2细胞APRIL mRNA水平的检测  Trizol法提取组织和细胞总RNA，核酸蛋白紫外分析仪检测RNA质量和浓度，要求D260／D280在1.8～2.0，并调整RNA浓度至1ng/μl。实时荧光定量RT-PCR反应体系20μl，包括上下游引物各0.4μl，待测样本总RNA或标准品1μl，加入96孔板，设立空白对照和无模板对照，于ABI 7000 Rael Time PCR扩增仪进行反转录及PCR反应。反转录反应：42℃ 15min，95℃ 2min；PCR反应：95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环。根据标准曲线，软件自动计算出待测样本中APRIL和β-actin的mRNA含量，以APRIL mRNA 和内参β-actin mRNA含量的比值作为评价APRIL mRNA表达水平的指标。

　　1.8  统计学分析  采用SPSS12.0统计软件，计量资料结果表示为均数±标准差，两组间计量资料采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  紫草素与顺铂对HepG2细胞增殖的影响  随着紫草素与顺铂浓度升高及作用时间延长，对HepG2细胞增殖的抑制率也随之升高。其中紫草素在作用24h、48h、72h的IC50分别为 2.11μg/ml、0.83μg/ml、0.29μg/ml，顺铂在作用24h、48h、72h的IC50分别为37.4μg/ml、14.9μg/ml、6.2μg/ml。

　　2.2  肝癌细胞株HepG2上APRIL的表达  免疫组化结果显示，HepG2细胞胞浆可见明显的棕黄染色，细胞核未见染色（见图1），故HepG2细胞上有APRIL蛋白的表达。实时荧光定量RT-PCR结果显示，HepG2细胞APRIL mRNA表达值为0.46±0.05。

　　图1  APTIL在肝癌细胞株HepG2上的表达（免疫组化法）（略）

　　A：HepG2细胞，APRIL呈强弱不等的阳性表达（×100）；B：HepG2细胞，APRIL阳性染色主要定位于细胞胞浆（×200）

　　2.3  紫草素与顺铂对HepG2细胞表达APRIL mRNA水平的影响  以药物作用时间及HepG2细胞APRIL mRNA水平（均数±标准差）作曲线图（见图2），可见加入不同浓度的紫草素后，与作为对照的顺铂一样，HepG2细胞APRIL的mRNA水平均逐渐升高，至72h表达最高与空白对照（不加药物）相比有显著差异（均为P<0.05），其中2.88μg/ml的紫草素作用72h时，APRIL mRNA的相对水平高达0.83±0.06（与空白对照相比t=16.411，P<0.001）。

　　图2  紫草素和顺铂对HepG2细胞表达APRIL mRNA水平的影响（略）

　　3  讨论
   
　　原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的原发性肝癌多发生于慢性乙型病毒性肝炎和肝硬化，发现时许多病人已处于中晚期，肝动脉插管化疗等措施成为必要手段。化疗药物毒性大、疗效有限且治疗后肿瘤易复发，故寻找副作用小且有效的联合治疗手段有重要意义。
   
　　紫草素及其衍生物是中药紫草的有效化学成份，近来的研究显示，它能抑制多种肿瘤细胞的生长［1］，其机理可能与通过激活Caspase蛋白酶家族、引起Bcl－2蛋白家族表达变化、抑制肿瘤坏死因子受体相关蛋白表达等途径导致肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤血管生成等有关［3～5］。增殖诱导配体（APRIL）是肿瘤坏死因子超家族的新成员［2］，在正常组织中表达很弱，却在多种肿瘤细胞及组织有高效表达［2，6］。对肿瘤细胞的增殖作用是目前所认为的APRIL最主要和重要的功能，它可促进肿瘤的形成及肿瘤细胞的增殖与存活，保护肿瘤细胞不受某些死亡配体和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导而凋亡［6～8］，故它在肿瘤组织和细胞中的高表达被认为是肿瘤进展的因素之一。
   
　　在我们的研究结果中，与其他研究一样，紫草素能明显地抑制肝癌细胞HepG2细胞的增殖，但是，它在抑制HepG2细胞增殖或杀灭癌细胞的同时，残存细胞的APRIL mRNA的水平却越来越高，即预示残存癌细胞增殖能力可能一定程度上反而升高，我们同时用肝癌经典化疗药物顺铂作为对照，发现顺铂同样有类似的现象，故有必要进一步从蛋白等水平证实上述现象及其它化疗药物是否存在相似情况。
   
　　不论如何，紫草素具有抑制肝癌细胞增殖的功能且没有顺铂等化疗药物的副作用，具有一定的应用前景，但同时也提示，在运用紫草素或顺铂治疗原发性肝癌时，因为APRIL在癌细胞中存在高表达和治疗后残存细胞的APRIL mRNA水平进一步升高，同时辅予对抗APRIL功能的治疗措施可能具有潜在的重要作用。

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作者单位：中山大学附属第三医院消化内科，广东 广州 510630; 中山大学附属第三医院中医科，广东 广州 510630