高效液相色谱-蒸发光检测器测定食品中的三氯蔗糖

【摘要】  目的 建立食品中三氯蔗糖含量测定方法，并对前处理进行优化。 方法 采用高效液相色谱仪（HPLC），蒸发光检测器（ELSD），SUPELCO Discovery C18 4.6×150mm色谱柱, 柱温：35℃，流动相由乙腈和超纯水组成，流速为1.0ml/min，蒸发管温度:40℃，气体压力3.5bar,放大倍数为6。 结果 采用HPLC-ELSD方法,其工作曲线的线性范围:0.1005～0.8040mg/ml,相关系数:r=0.99993,回收率:94.3%～97.1%,精密度(n=6):1.9%～2.3%。 结论 方法准确、可靠,可用于三氯蔗糖的检测。

【关键词】  三氯蔗糖 高效液相色谱 蒸发光检测器

　　Determination of sucralose in food by HPLC-ELSD.

　　LU Lin, HANG Y i-ping, GAO Yan-hong.

　　(Postgraduate, Chemical Science College of Huanan Physical and Industrial University, Guangzhou 510640, Guangdong, P. R. China)
   
　　Abstract：Objective  To establish an optimized method for determination of sucralose in foods.  Methods  High performance liquid chromatography(HPLC) was used to determine sucralose in food respectively link with evaporative light scattering detector (ELSD),The column was SUPELCO Discovery C18 4.6×150mm, column temperature was 35℃, the mobile phase was made of acetonitrile and water with flow rate 1.0ml/min，The temperature of evaporative pipe is 40℃,the gas pressure is 3.5bar, the zoom in multiple is 6.  Results  The linear range of the calibration curve of HPLC-ELSD were from 0.1005～0.8040mg/mL(r=0.99993).The recoveries were 94.3～97.1% and the relative standard deviations(n= 6) were 1.9%～2.3%.  Conclusion  The method was accurate、reliable, which can be used to determine sucralose in foods.
   
　　Key words：Sucralose; High performance liquid chromatography; Evaporative light scattering detectors

　　三氯蔗糖是以蔗糖为原料合成的一种蔗糖衍生物，分子量为397.5。外观为白色或近白色结晶粉末，无臭、无吸湿性、低热值，对光、热、酸碱值均很稳定，甜度为蔗糖的600倍，极易溶于水、乙醇和甲醇，微溶于乙酸乙酯。三氯蔗糖广泛应用于饮料、口香糖、乳制品、蜜饯、果冻布丁、面包、糕点饼干、冰淇淋和果酱等加工食品中，可供糖尿病患者、肥胖和心血管病人食用。FAO/WHO规定其每日允许摄入量为0～15mg/kg体重，有报道食品中三氯蔗糖的含量测定有用离子色谱、高效液相和气相质谱法，我国目前对三氯蔗糖的检测还没有相应的国标检验方法［1,2］。近三年来我们一直都在致力于研究食品甜味剂的检测，为使检测工作快速有效进行，我们在总结前人工作的基础［3～5］上对样品前处理、仪器条件的选择进行了改进，结果表明,改进后的实验方法能快速、准确地测定食品中的三氯蔗糖。

　　1  实验部分

　　1.1  仪器与试剂  DIONEX Summit 高效液相色谱仪; SEDEX 75蒸发光检测器; 超声振荡器; 涡旋式混合器; HITACHI CR22G高速离心机。
   
　　乙腈(色谱纯)、石油醚(沸程30～60,分析纯)、乙酸锌(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、三氯乙酸、超纯水、三氯蔗糖标准品(Wako公司生产纯度≥98.0%)；样品处理过程用水均为二级去离子水。

　　1.2  色谱条件  色谱柱：SUPELCO Discovery C18柱 5μm 15cm×4.6mm；进样体积20μl；柱温：35℃；SEDEX 75蒸发光检测器 蒸发管温度:40℃；气体压力3.5bar；放大倍数为6。流动相由乙腈和超纯水组成，流速：1.0ml/min；梯度洗脱程序见表1。

　　表1  流动相梯度洗脱时间（略）

　　1.3  样品前处理

　　1.3.1  液体样品  饮料或口服液等澄清的液体样品可直接过0.45μm 滤膜,待液相色谱上机测定。如果液体样品有一些黏稠如酸乳味的饮料，可将原液置于塑料离心管中12 000～20 000r/min离心5min，取上清液过0.45μm 滤膜,待液相色谱上机测定。

　　1.3.2  固体样品  准确称取研磨至碎样品约2.0g(约含三氯蔗糖1.0mg)置于离心管中，准确加入10.00ml蒸馏水充分溶解并振摇3～5min后超声10min, 12 000～20 000r/min离心5min，上清液过0.45μm 滤膜,待液相色谱上机测定。

　　1.3.3  样品的脱脂与沉淀蛋白处理  样品脂肪含量过高会影响三氯蔗糖的提取，可按以下步骤进行脱脂：将样品(固体样品要先按1.3.2溶解振摇后再处理)置于离心管中，加入10.0ml石油醚，玻棒搅拌均匀后并在震荡摇床上震摇3～5min，然后以3 000r/min离心5min，小心吸取并弃去石油醚，注意不要吸出水层样品，重复1～3次提取至脂肪完全除去。用氮气或空气蒸发掉残留的石油醚，水层样品先超声10min，再12 000～20 000r/min离心5min，上清液过0.45μm 滤膜，待液相色谱上机测定。
   
　　样品中含有蛋白对整个色谱系统尤其是对液相色谱柱会产生不良影响，因此当样品中蛋白质的含量超过1%时应在前处理过程中沉淀蛋白，本方法选择20%乙酸锌溶液1～2ml和6mol/L氢氧化钠2滴作为沉淀剂或20%三氯乙酸溶液2ml。

　　1.4  测定

　　1.4.1  三氯蔗糖标准储备液配制  准确称取102.6mg 三氯蔗糖标准品于小烧杯中，加入适量的水溶解，于100mL的容量瓶中定容至刻度，相当于浓度为1.005mg/ml的标准溶液。过0.45μm滤膜备用。

　　1.4.2  三氯蔗糖标准溶液配制  准确吸取三氯蔗糖标准溶液1.00、2.50、 5.00、8.00ml于10.0ml容量瓶中,加水至刻度,得到浓度分别为0.1005、0.2512、0.5025、0.8040mg/ml的三氯蔗糖标准使用液，过0.45μm滤膜备用。

　　1.4.3  样品测定  取样品处理液自动进样20.0μl，以保留时间定性,根据外标法以峰面积定量。

　　2  结果与讨论

　　2.1  仪器条件的选择  蒸发光检测器检测三氯蔗糖时，蒸发管温度:40℃；气体压力3.5bar；放大倍数为6时检测灵敏度较高，毛刺峰较少，峰形对称，特别是通过流动相梯度洗脱，使三氯蔗糖在13～14min出峰可尽可能减少水溶性杂质的干扰，典型的样品溶液液相色谱图见图1。

　　图1  HPLC-ELSD测定三氯蔗糖样品溶液液相色谱图（略）

　　2.2  样品前处理脱脂试剂的选择  根据文献［6］，食品中脂肪类杂质采用正己烷除去效果很好，但我们知道正己烷从呼吸器官和皮肤进入人体后会对神经系统有明显的毒副作用，而石油醚同样对脂肪的抽提效果明显且毒性相对正己烷要低得多、挥发速度更快，因此本方法选择石油醚作为脱脂剂。

　　2.3  样品前处理沉淀剂的选择  根据国标方法，对食品样品我们通常采用乙酸锌和亚铁氰化钾来沉淀蛋白，刚开始摸索方法时我们也是采用这两种试剂来沉淀蛋白，但后来通过试验比对发现加入这两种试剂后色谱系统变得很不稳定，色谱图谱的毛刺峰大量增加，对样品测定造成干扰，使方法精密度和准确性变差。为了明确干扰来源，我们分别用乙酸铅来取代乙酸锌与氢氧化钠来取代亚铁氰化钾，结果表明氢氧化钠取代亚铁氰化钾后色谱图谱的毛刺峰减少显著，且目标峰附近的毛刺大量减少，基本不影响结果定量，同时我们还选用了三氯乙酸作为沉淀剂来沉淀蛋白，色谱分析效果甚佳，但考虑到三氯乙酸酸性较强，长期使用对色谱柱的使用寿命有很大影响，因此本方法选择沉淀蛋白效果明显且对分析定量影响较小的乙酸锌和氢氧化钠作为沉淀剂。

　　2.4  线性关系及仪器检出限  配制浓度分别为0.1005、0.2512、0.5025、0.8040mg/ml的标准使用液，进样量为20μl，其峰面积的响应值分别为1.001、3.509、8.860、17.124mv×min，以三氯蔗糖标准的含量C(μg)为横坐标，以峰面积A为纵坐标，校正得到回归方程为:A=22.89C1.362
   
　　将公式两端同时取自然对数得到双对数线性方程式：
   
　　log10A=1.362log10C+1.360  线性相关系数r = 0.99993
    　
　　表明三氯蔗糖在2.0～1.6μg含量范围内峰面积与含量呈良好的幂函数关系；取0.1005μg/μl的标准溶液稀释10倍成0.01005μg/μl，进样10μl，发现其峰高响应值约为噪音的3～5倍，因此在此方法的实验条件下，仪器检出限为0.10μg。

　　2.5  精密度试验  分别取果汁饮料和羊奶片样品各一份(阴性样品)，各加标0.412、0.824 g/kg，然后按照1.3样品处理要求处理好样品待检。对每个样品连续分析6次,精密度试验结果见表2。

　　表2  精密度试验结果（略）

　　2.6  方法回收率  分别取八宝粥和口喉片样品各一份(阳性样品)，各加标0.210g/kg，然后按照1.3样品处理要求处理好样品测定。计算回收率在94.3%～97.1%之间，见表3。

　　表3  回收率试验结果（略）

　　3  小结
   
　　蒸发光检测器(ELSD)检测三氯蔗糖时，检测灵敏度高，峰形对称、抗本底干扰能力强，特别是通过流动相梯度洗脱，使三氯蔗糖在13～14min出峰可尽可能减少水溶性杂质的干扰。
   
　　ELSD检测器作为质量检测器，它是一种与所检测的物质和洗脱液的物理、化学性质无关的通用型检测器，其色谱峰的面积仅与峰中所含物质的质量有关，主要应用于大多数非挥发和半挥发性物质领域，尤其适用于糖类和脂类物质的分析。本实验采用ELSD检测器测定三氯蔗糖，能较好地测定奶粉、口含片、口服液、酱油、八宝粥等样品中三氯蔗糖含量。

【参考文献】
  　　［1］ 中国食品工业标准汇编.食品添加剂卷(上)［M］.北京:中国标准出版社,1997,7 .

　　［2］ 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.中华人民共和国国家标准. 食品卫生检验方法 理化部分(二)［S］. GB/T 5009.140-2003.

　　［3］ Nojiri S, Nakazato M, Kasuya Y, et al. Determination of Sucralose in foods by HPLC using pre-column derivatization［J］. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2002, 43(5):289～294.

　　［4］ 陈玉宏,陈炳灿. 滴定法测定食品添加剂中三氯蔗糖含量［J］. 预防医学论坛, 2007,13(05):445～446.

　　［5］ Valoran P, Hanko and Jeffrey S, et al. Determination of Sucralose in Sp lenda and Sugar - Free Beverage Using High - Performance Anion- Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection［J］. Food Chem, 2004, 52(14):4375～4379.

　　［6］ 熊丽蓓,戴承兵,何倩琼. 高效液相色谱法测定食品中三氯蔗糖含量的研究［J］. 上海预防医学杂志，2005, (04)：156～158.

作者单位：广东省疾病预防控制中心，广东 广州 510300； 华南理工大学，广东 广州 510640.