自体CIK细胞免疫疗法治疗中晚期非小细胞肺癌的临床研究

【摘要】  目的 观察自体CIK细胞过继性免疫疗法对中晚期非小细胞肺癌患者的临床疗效。 方法 体外利用抗CD3单抗、IL2、IFNγ等细胞因子从患者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导扩增CIK细胞,培养11～14 d后，分3个疗程回输患者体内，观察患者临床症状改善及生活质量改善状况，并用流式细胞仪检测回输前后患者T细胞亚群和NK细胞变化。 结果 86例接受自体CIK细胞治疗患者中,PR+MR为72例,总缓解率为83.72%。治疗前、后肿瘤患者临床症状有明显改善,有显著性差异（P<0.01）。CIK细胞经培养后细胞总数和CD3、CD56 T效应细胞均获得大量增殖,自体回输免疫治疗后,CD3、CD4 T细胞和NK细胞比例均显著提高(P<0.01)。 结论 从中晚期非小细胞肺癌患者外周血PBMC中可高效扩增CIK细胞，自体回输能显著提高患者免疫功能，改善临床症状,提高生存质量,延长患者生存期。

【关键词】  CIK细胞； 过继免疫治疗； 非小细胞肺癌

The Clinical Study on the Therapeutics of Cytokineinduced Killer Cells  on the Patients with Advanced Nonsmallcell Lung Cancer

    WEI Biao1, JIANG Wenjun2, TANG Xiaolan2(1.The Second Peoples Hospital of Yibin, Sichuan Yibin 644000; 2.Cancer Hospital of Sichuan Province, Chengdu 610041, China)

    【Abstract】  Objective  To observe the therapy effect of cytokineinduced killer (CIK) in PBMC of patients with advanced nonsmallcell lung cancer. Methods  CIK cells were induced and amplified from PBMC of 68 NSCLC patients by in vitro incubation with IL2，IFNγ，antiCD3 monoclonal antibody for 1114 days and then transfused back to patients. The changes of T cell and NK cell of patients before and after CIK cell treatment with FCM were tested. Results  After 1114 days culture, the total number of CIK cells and CD3+，CD56+ T cells expanded greatly. After being treated with CIK cells, the numbers of CD3，CD4 T cell and NK cells of patients increased significantly (P<0.01). The clinical symptoms of 86 patients were improved clearly.  Conclusion  CIK cells may be expanded effectively from patients with advanced NSCLC. The adoptive immunotherapy of autoimmunity of CIK cells can significantly enhance cellular immune function and improve the  clinical symptom of patients.

    【Key words】  cytokineinduced killer cells; adoptive immunotherapy; nonsmallcell lung cancer

    CIK细胞（cytokineinduced killer cell）是目前所知杀伤活性较强的肿瘤生物治疗效应细胞，其主要表达T细胞标记的CD3细胞和表达NK标记的CD56细胞。正常情况下，人体CD3、CD56表型的细胞仅占外周血细胞的1%～5％，肿瘤患者其T细胞功能则更低。自体CIK细胞免疫疗法就是从人体外周血中分离CD3、CD56以及CD4、CD8等细胞，在体外大量扩增后再回输到体内，以迅速提高机体T细胞免疫功能［1］。国内外已有研究表明，大量输注CIK细胞的作用能提高乳腺癌等恶性肿瘤患者自身免疫细胞功能，清除手术、放、化疗后体内残留的肿瘤细胞及微小转移病灶，从而延缓或减少复发，提高肿瘤的治愈率和生存率。作者从2003年至2007年对86例中晚期非小细胞肺癌患者采用自体CIK细胞免疫疗法进行了过继性免疫治疗，并对其临床疗效进行了观察，现报告如下。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    病例来源于宜宾市第二人民医院、四川省肿瘤医院、四川省人民医院以及成都陆军总医院收治的晚期非小细胞肺癌患者共86例，均经临床及病理学检测为中晚期恶性肿瘤，患者年龄最小37岁，最大74岁，平均年龄52.6岁。

    1.2  研究方法

    1.2.1  CIK细胞体外扩增与检测  患者常规治疗结束或间隙期10 d左右,静脉采血约50 ml，肝素抗凝,Ficoll淋巴细胞分离液（1∶1）分离单个核细胞(PBMC),生理盐水洗涤3次，用RPMI 1640培养基(含10%人AB 血清),调节密度为2×106/mL,第0 d加入2000 U/mL重组IFNγ约8万单位,36.5℃,5% CO2孵箱培养24 h, 第2 d，加入IL2（终浓度为1000 U/mL）以及5 μg/mL抗CD3单抗。每3天离心换培养液一次（第4、7、10、13 d），同时补加IL2 100 U/mL，用台盼蓝拒染法记数PBMC,流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8、NK细胞中的CD16和CD57等免疫学指标。

    1.2.2  自体CIK细胞过继性免疫治疗  于培养两周左右时间开始收集CIK细胞,生理盐水洗涤3次,加入5%人血白蛋白、1 000 U/ml IL2,用生理盐水配成250ml后静脉回输,隔天回输1次,每次回输约109个细胞，每疗程3次, 回输前均经无菌检测，达到质控标准后方可回输。

    1.2.3  临床相关指标的检测  治疗前及治疗2周后,用流式细胞仪检测患者外周血CD3、CD4、CD8及CD16、CD56，治疗前后检测患者体温、血压、肝肾功能等指标。

    1.2.4  毒副反应观察  密切观察患者接受免疫治疗后是否出现发热、皮疹、失眠、乏力、食欲不振等毒副反应，根据病情予以处理。

    1.2.5  统计方法  所有数据均以均值±标准差(±s)表示,统计检验采用t检验。

    2  结果

    2.1  CIK细胞扩增与表型检测

    CIK细胞于培养第4 d开始快速增殖,至13 d细胞增殖为1.0×109～5.0×109，平均增殖100倍，CD3+、CD56+  T细胞比例由1.8%左右上升为约25%.

    2.2  治疗前后的T细胞亚群和NK细胞变化

    经自体CIK细胞免疫治疗1～3个疗程的患者，其外周血中CD3、CD4 T细胞和NK细胞（CD16、CD56）均显著上升(P<0.05),见表1.

    2.3  临床观察情况

    CIK细胞回输后,部分患者的睡眠、食欲、体力均有所改善者, 按临床症状积分值下降≥2/3为显著改善,积分下降1/3为部分改善,积分下降<1/3为无改善,结果见表2。通过对患者行CT及B超等常规检查，参照实体瘤疗效标准，以完全缓解(CR)0，部分缓解(PR)27,轻度缓解(MR)45,稳定(SD)12,进展(PD)2进行疗效评定,总缓解率（CR+PR+MR）为83.72%.表1  患者接受CIK细胞免疫治疗前后外周血免疫学指标变化表2  86例患者CIK免疫治疗前后患者临床症状改善分析

    2.4  毒副反应观察

    极少数患者（4例）细胞回输后出现体温升高（38.2℃～39.5℃），经抗生素治疗处理后症状消失，8例患者出现轻度皮疹、乏力等症状，原因未明，大多数患者无不良反应。

    3  讨论

    　　过继性免疫治疗是对肿瘤患者进行辅助治疗的重要手段,已在临床上得到较多的应用，如TIL、CD3AK等细胞疗法，但大都存在着体外增殖倍数不够、毒副作用大等缺点，临床应用受到了限制［ 2］。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK),是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞，与LAK和TIL、CD3AK等细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、对正常骨髓造血毒性小等优势［3，4］。CIK细胞是Schmidt等于1991年率先发现的，该细胞共同表达了CD3和CD56两种膜蛋白分子，是目前所知杀伤活性最强的一种肿瘤生物治疗效应细胞［5］，研究认为CIK细胞对肿瘤的杀伤作用是通过释放颗粒酶、穿孔素而裂解靶细胞，对靶细胞的裂解是CIK细胞杀伤靶细胞的主要机制，也有学者认为进入体内活化的CIK细胞可分泌多种细胞因子如干扰素γ、肿瘤坏死因子和白介素2等,不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，而且还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞［6，7］。

    但肿瘤患者由于免疫功能受到极大损害，其外周血中CIK细胞极低（远低于正常人的1%～5%），必须通过细胞生物学方法在体外大量扩增，达到一定的数量级后方可回输。常用的CIK细胞体外培养扩增方法较多，其细胞增殖时间及倍数都有差异，我们采用的CD3单抗、IL2、IFNγ等细胞因子培养方法，经过两周左右的时间培养传代，细胞数量基本能达到1×109以上。T细胞亚群和NK细胞活性是反映肿瘤患者免疫功能的重要指标，通过对比患者接受自体CIK细胞免疫治疗前后，其T细胞亚群和NK细胞比例的变化,能发现患者免疫功能改善［8］。我们对86例非小细胞肺癌患者，采用流式细胞仪方法检测，结果显示该疗法可以明显提高CD3T细胞和NK细胞（CD16、CD56）的比例(P<0.01)，缓解、提高CD4/CD8比率,增强患者的细胞免疫功能，这对于肿瘤患者及其低下的免疫功能具有具有重要意义。在改善患者临床症状方面，86例 NSCLC患者经13个疗程的CIK细胞免疫治疗后，总缓解率达83.72%（72/86），见表2。多数患者临床症状如倦怠乏力、失眠、食欲不振等均有明显改善，见表3。在毒副反应方面大多数患者无不良反应，仅极少数（4例）出现不同程度的发热，经处理后症状都消失。

    作者采用自体CIK细胞过继性免疫疗法治疗86例中晚期非小细胞肺癌患者，结果表明大多数患者临床疗效较好，毒副反应轻微，患者临床症状得以改善，生活质量明显提高，可在一定程度上减缓NSCLC的转移和复发，但该疗法的远期疗效及其对肿瘤患者生存期的影响，仍需长期跟踪随访，进一步深入研究。

【参考文献】
  ［1］Marten A,Renoth S,Von Lilienfeld2toal M, et al. Enhanced Iytic Activity of Cytokineinduced Killer Cells Against Multiplemyeloma Cells after Coculture with Idiotypepulsed Dendritic Cells［J］. Haematologica, 2001,86(10):1 0291 037.

［2］Hoffmant DM, Gitlitz BJ, Belldegrun A, et al. Adoptive Cellular Therapy［J］. Semin Oncol,2000,27(2):221233.

［3］Fu SW, Ming XL, Bing Z, et al. Antitumor Activities of Human Autologous Cytokineinduced Killer Cells Against Hepatocellular Carcinoma cells in Vitro and in Vivo［J］. World J Gastroenterol，2002,8(3):464468.

［4］Maki G. Exvivo Purging of Stem Cell Autografts Using Cytotoxic Cells［J］. Hematother Stem Cell Res，2001,10:545551.

［5］SchmidtWolf IG, Lefterova P, Johnston V, et al. Sensitivity of Multidrugresistant Tumor Cell Iines to Immunologic Effector Cells［J］. Cell Immunol，1996,169:8590.

［6］Finke S, Trojaneck B, Lefterova P, et al. Increase of Proliferation rate and Enhancement of Antitumor Cytotoxicity of Expanded Human CD3+ CD56+ Immunologic Effector Cells by Receptormediated Rransfection with the Interleukin7 Gene［J］. Gene Ther，1998,5:3139.

［7］Zoll B, Lefterova P, SchmidtWolf IG, et al. Modulation of Cell Surface Markers on NKlike T lymphocytes by Using IL2, IL7 or IL12 in Vitro Stimulation［J］. Cytokine，2000,12:1 3851 390.

［8］Alvarnas JC, Linn YC, Hope EG,et al.Expansion of Cytotoxic CD3+ CD56+ Cells from Peripheral Blood Progenitor Cells of Patients Undergoing Autologous Hematopoietic Cell Transplantation［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2001,7:216222.