凋亡抑制因子Survivin在肾癌中的表达及意义

【摘要】  目的 探讨新的凋亡相关基因Survivin蛋白在人肾细胞癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化SABC法分别测定52例肾细胞癌组织和10例正常肾组织中Survivin蛋白的表达，并分析其与肾癌临床、病理因素的关系。结果 Survivin蛋白在肾癌组织中表达，阳性率为92.31%(48/52)，其中弱阳性为19例，中等阳性为12例，强阳性17例，而正常组织中未见表达，二者有统计学意义(P<0.01)。肾癌中Survivin蛋白的表达与患者有无淋巴结转移、肾癌的病理分级呈正相关(P<0.05)，而和肾癌患者的年龄、性别、肿瘤大小及有无下腔静脉癌栓、肾癌患者的Robson分期及肿瘤的病理类型无显著相关性。结论 肾癌的分化程度越低，越容易出现淋巴结转移，则Survivin阳性表达率越高，提示检测肾癌中Survivin蛋白的表达，可作为肾癌诊断的灵敏、特异的指标，并有助于肾癌的预后评估。

【关键词】  肾癌；Survivin；免疫组织化学

    Expression and significance of the inhibitor of apoptosis, Survivin, in renal cell carcinomas

    Yan Jieke1, Xu Zhonghua2, Wang Hongwei1, Tian Chuan1, Liu Shuangde1, Xu Dongsheng1, Liu Xiaoli1

    (1. Department of Urology, Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033; 2. Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)ABSTRACT: Objective  To investigate the expression and the clinical significance of survivin proteins in tissues of renal cell carcinoma (RCC). Methods  Expression of survivin proteins were detected by immunohistochemical technique in tissues of 52 cases of renal cell carcinoma and 10 cases of normal kidney. Results  Survivin was undetectable in all normal renal tissue, while it was expressed in 92.31% (48/52) of the RCC. In RCC, there was significant correlation between the expression of survivin and lymph node status, but no association between the expression and some clinical characters, including patient age, sex, tumor size and carcinomatous embolus status in inferior vena cava. There was significant relation between the expression of survivin and the pathologic features(P<0.05). No significant difference was observed between the expression of survivin and the clinical stage in RCC. The type of pathology of RCC was not correlated with the expression of survivin. Conclusion  These results suggest that the expression of survivin may be upregulated during the development of human renal cell carcinoma. Therefore, survivin might be a useful criterion to propose the diagnosis of RCC.

    KEY WORDS: renal cell carcinoma (RCC); survivin; immunohistochemistry
   
     我们采用免疫组织化学染色技术检测肾癌组织中Survivin蛋白的表达，并结合临床病理特征进行分析，以探讨Survivin在肾癌组织中的表达及临床病理学意义。

    1  材料与方法

    1.1  临床资料  本组52例患者标本(年龄35-74岁，平均55岁)取自山东大学齐鲁医院和山东大学第二医院泌尿外科2002年11月-2005年3月经手术切除的肾脏肿瘤，均经病理证实，诊断明确、术前未经放疗、化疗，且保存完好。10例肾脏良性病变切除的肾组织作为正常对照。所有标本均经10%(体积分数)甲醛溶液固定48h，常规石蜡包埋。肿瘤标本病理分级按WHO的分级标准，G1级10例，G2级30例，G3级12例；根据Robson分期，Ⅰ期14例，Ⅱ期16例，Ⅲ期18例，Ⅳ期4例。

    1.2  检测方法  采用高敏SABC免疫组织化学染色技术。一抗为兔抗人Survivin多克隆抗体(1∶20)，二抗为羊抗兔IgG(1∶120)。以上抗体及试剂盒分别购自Santa Cruz公司及北京中山生物工程公司等。以该公司提供的阳性片做阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

    1.3  结果判定标准[1]  Survivin阳性染色呈棕黄色，主要定位于细胞浆。双盲阅片，20×10倍显微镜下随机观察10个视野， 按阳性细胞比例分为：0级，无棕黄色颗粒出现或染色范围<1%；1级，染色范围1%-25%；2级，染色范围26%-50%；3级，染色范围51%-75%；4级，染色范围>75%。按染色强度分为：0级，无棕黄色颗粒出现；1级，可辨认的淡黄色；2级，亮黄色；3级，棕黄色。将每张切片的染色强度和阳性范围的分相加分为：-，0、1；+，2、3；，4、5；，6、7。

    1.4  统计分析  所有资料采用CS10.32统计学软件，应用非参数统计中spearman等级相关、卡方检验及Fishers精确概率法进行统计分析，以P<0.05为差异有显著性意义。

    2  结    果

    Survivin蛋白在肾癌组织中表达(图1)，而正常组织中未见表达(图2)。肾癌组织中的阳性染色呈棕黄色颗粒，主要定位于癌细胞浆，少部分癌细胞胞核亦有染色反应，阳性率为92.31%(48/52)。其中弱阳性为19例，中等阳性为12例，强阳性17例。统计分析表明肾癌组织中Survivin的表达率显著高于正常对照组，两者之间有统计学意义(P<0.01)。肾癌中Survivin的表达和肾癌患者的年龄、性别、肿瘤大小及有无下腔静脉癌栓无显著相关性(P>0.05)；有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)(表1)。肾癌的病理分级越高，Survivin的表达率越强(P<0.05)(表2)。肾癌患者的临床分期(Robson分期)及癌细胞的病理类型与Survivin的表达无显著相关性(P>0.05)。

    图1  肾癌组织中Survivin的阳性表达 (×200)3  讨    论

    肾癌的发生不仅与肿瘤细胞的增殖，而且与其凋亡有密切关系。研究表明，与凋亡相关的P16、Rb、Cmyc等因子与肾癌的发生有密切关系[2]。本实验

    图2  正常肾组织中Survivin的阴性表达 (×100)表1  52例肾癌患者Survivin表达与临床病理特征指标的关系表2  肾癌患者的病理分级与Survivin表达的关系从另一个抑癌基因Survivin来探讨肾癌的发生发展。Survivin是1997年由美国的Ambrosini等发现的一种新的抗细胞凋亡因子[3]，是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的新成员，是迄今为止最小的hIAP蛋白。在调控细胞周期和抑制细胞凋亡中起重要作用，主要表达于细胞的G2/M期，Survivin通过直接与caspase3和caspase7结合而抑制多聚ADP核糖聚合酶(poly ADPribosepolymerase，PARP)裂解来阻断凋亡过程[4]。另外，Survivin也可通过阻止p21间接抑制Caspase3的活化,从而抑制细胞凋亡[5]。

    Survivin蛋白的组织分布与其他细胞因子有着显著的不同。Survivin基因在胚胎发育时期广泛表达，而在成人正常分化的组织中除了胸腺等少数组织外极少表达，即使在正常情况下增生比较活跃的组织如皮肤鳞状上皮的基底细胞层细胞、骨髓组织和淋巴结也不能检测出。本实验结果显示92.31%的肾癌组织中可发现不同程度的Survivin阳性表达，而在10例来自肾脏良性病变切除标本的正常对照中，都未检测出Survivin蛋白，这说明Surivivin蛋白在肾癌组织有高度选择性表达的特性，可能是参与肾癌发生的机制之一。Lehner等 [6]报道45例不同期膀胱癌中Survivin染色阳性26例，而正常膀胱黏膜、良性膀胱肿瘤、膀胱癌前病变标本Survivin染色均为阴性。高分化组膀胱移行细胞癌中Survivin表达低于低分化组。Survivin蛋白表达阴性的膀胱移行细胞癌Ⅰ期病例首次复发时间为20-50个月，Survivin蛋白表达阳性者为6-18个月，两者相比差异有显著性，因而Survivin蛋白阳性表达是膀胱移行细胞癌复发的高危因素。Survivin独特的表达特点，使之可被应用于肿瘤的预测。另一方面，实验结果也说明Survivin可能不参与正常肾组织细胞凋亡的调节。在正常机体中Survivin基因是失活的，只有在致癌因素作用下产生基因水平的突变引起Survivin的激活才使组织细胞发生凋亡平衡的紊乱，而使Survivin蛋白得以表达。这种正常组织不表达的特性对于抗肿瘤治疗有重要意义，在对肾癌患者进行以Survivin为靶向基因的免疫治疗时，抑制Survivin蛋白的表达和功能不会损伤到正常组织。这一特性，为临床上解决目前治疗恶性肿瘤的各种非手术方法对人体正常组织损伤大、靶向特异性差的问题提供了新的思路。

    在评估Survivin蛋白表达和肾癌各临床病理学参数的关系时，我们发现Survivin的表达与肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小和下腔静脉癌栓的有无等无显著相关性，Survivin蛋白的表达在肾癌发生的各个时期皆可出现，可以初步认为Survivin的表达可能是肾癌发生中的早期事件，这与在结肠癌、胰腺癌中的研究报道是一致的 [78]。同时我们发现在有肾门淋巴结转移的患者组中Survivin蛋白表达阳性率显著高于无淋巴结转移的患者组，在这些阳性表达患者中Survivin蛋白的表达强度也普遍偏高，这提示Survivin蛋白的表达与肾癌的恶性生物学行为有关，Survivin蛋白的持续高表达可能进一步参与恶性肿瘤的临床进展。在肺癌、乳腺癌、肝癌的研究中也显示Survivin蛋白的表达不仅与肿瘤的浸润转移等恶性生物学行为有关，而且与患者术后复发、存活时间缩短有关，可作为一个独立的判断预后的指标[910]。监测Survivin蛋白的表达对于肾脏恶性肿瘤的诊断和预后的判断具有一定的价值。

    在不同组织病理学分级的肾癌中Survivin蛋白的表达应用了等级相关的方法进行整体比较，结果证实Survivin蛋白的表达与病理分级呈显著正相关。癌细胞的分化程度越低，Survivin蛋白的阳性表达率越高。提示Survivin蛋白的表达可能与肿瘤的恶性程度有关，其参与肾细胞癌的进展、浸润，其表达水平可能与肿瘤的预后相关。Survivin蛋白高表达可能提示肿瘤的恶性程度高，这可能与其促进内皮细胞的存活有关。因此，Survivin蛋白在分级较差的肿瘤组织中的高表达可能是因为其参与了肿瘤的进展与浸润，并从另一个角度证明了Survivin的高表达与肾脏恶性肿瘤患者的预后有一定的相关性。

    综上所述，鉴于凋亡抑制因子Survivin的特殊生物学特性及其与肾癌的密切相关关系，可以预测其在肾癌的诊断和治疗上可能产生积极的作用，Survivin的肿瘤组织特异性使其可望成为理想的肿瘤标记物，有助于早期正确诊断恶性肿瘤。另一方面，利用分子生物学技术调控Survivin基因表达，阻滞细胞增殖，促进细胞凋亡，可能发挥抑制肾细胞癌生长的作用，从而达到治疗肾癌的目的，这将可能成为人体恶性肿瘤基因治疗的突破口。

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作者单位：(1. 山东大学泌尿外科研究所，山东济南 250033；2. 山东大学齐鲁医院泌尿外科，山东济南 250012)