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【摘要】 目的 探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞 survivin基因3个不同靶序列的 shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒, 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin 基因mRNA表达水平。选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后, 免疫细胞化学法（ICC）检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖情况。结果与对照组比较，构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性（F=18.64,q=4.293～4.925，P<0.05），而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性（q=0.631～0.126，P>0.05）。转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调(F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01)，其增殖能力较对照组显著下降(F=20.06～47.65,q=11.186、 12.601，P<0.01)。结论 构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-survivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖。
【关键词】 肝肿瘤 Survivin RNA干扰 细胞增殖
近年来,凋亡蛋白抑制因子(IAP)家族成员中的survivin基因作为肿瘤基因治疗靶点受到瞩目,它在肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用。survivin 能抑制细胞凋亡,并参与血管生成［１］,是一种肿瘤特异性表达的凋亡抑制因子。RNA干扰(RNAi)技术是近年来产生的新兴生物技术，即将目的基因所对应的小分子双链 (dsRNA)导入生物体，导致相应的mRNA降解，从而阻断哺乳动物细胞中特定基因的表达。本研究利用RNAi技术,设计合成针对survivin 编码基因的小发卡RNA (shRNA)表达载体,将其转染入肝癌细胞HepG2中,在H1启动子驱动下,导入细胞的载体经RNA 聚合酶Ⅲ催化转录出shRNA，然后经Dicer 酶切形成效应小干涉RNA (siRNA),由此筛选出针对人肝癌细胞HepG2 survivin基因有效的shRNA真核表达载体,并进一步检测其对HepG2细胞增殖的影响，探讨RNAi survivin表达治疗肝癌的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 胎牛血清为杭州四季青公司产品； RPMI 1640购自Gibco 公司；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)相关试剂购自北京中山生物工程公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司；兔抗人survivin一抗、HRP标记羊抗兔IgG二抗购自北京中山生物工作公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司。
1.1.2 细胞株 人肝癌细胞株HepG2从青岛大学医学院附属医院中心实验室获得，在含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，温度为37 ℃，含体积分数0.05的CO2。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建 根据RNA设计原则和survivin（NM_001168） 编码序列，并利用BLAST 进行查询,确定并特异性设计合成3对survivin 编码序列siRNA片段,分别构建3个survivin 基因的重组载体pshRNA-survivin-323、pshRNA-survivin-387和pshRNA-survivin-52。设计基因靶点分别位于survivin基因序列第323、387、52位点,靶序列如下。survivin1:5′-GAGCCAAGAACAAAATTGC-3′;survivin2：5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′;su-rvivin3：5′-CGCATCTCTACATTCAAGA-3′。合成的DNA两端设计有Bam HⅠ或BbsⅠ酶切位点，便于与pGPH1/GFP/Neo载体连接。另设阴性对照表达载体pshRNA-survivin-NC和阳性对照表达载体pshRNA-survivin-GAPDH，以上载体均由上海吉玛制药公司构建。
1.2.2 细胞分组和转染 取对数生长期人肝癌HepG2细胞，传代接种于6孔板内，调整细胞浓度，使每孔细胞数为1×105，常规条件下培养24 h，显微镜下观察细胞融合达到约80％时开始实验。分为空白对照组、阴性对照组、pshRNA-survivin-323转染组、pshRNA-survivin-387转染组和pshRNA-survivin-52转染组，每组设3个复孔。转染过程按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行，转染48 h后收集各组细胞。
1.2.3 RT-PCR检测survivin mRNA水平 收集各组培养细胞，调整细胞浓度为（5～10）×106/L，用TrizoL法提取总RNA。RT反应采用10 μL反应体系(内含待测RNA 2 μL，AMV 0.5 μL及适当浓度的OligodT、dNTP和氯化镁)，42 ℃反应60 min，95 ℃反应10 min以合成cDNA。PCR反应体系为25 μL，反应条件：94 ℃反应45 s，55 ℃反应45 s，72 ℃反应1 min，共35个循环。所得PCR产物在含EB的2 g/L的琼脂糖凝胶中电泳分离，在紫外线灯下分析结果。所用的survivin引物序列：上游引物序列为5′-TCAAGGACCACCGCATCTCTA-3′，下游引物为5′-CCAGCTCCTTGAAGCAGAAGAA-3′，扩增片段大小为156 bp。以GAPDH作为内参照，其上游引物序列为5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′， 下游引物序列为5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，扩增片段大小为146 bp。应用分析软件作相对定量分析，以survivin mRNA表达的吸光度（A）值／GAPDH（A）mRNA表达A值（Asurvivin/AGAPDH）表示survivin mRNA水平。比较各组survivin mRNA的表达水平，然后筛选出抑制肝癌HepG2细胞survivin基因mRNA 表达最有效的shRNA表达载体,在后继实验中均以该特异性shRNA表达载体转染的细胞为实验组。
1.2.4 免疫细胞化学法（ICC）检测survivin蛋白表达 筛选出干扰最有效的质粒后重新分为空白对照组、阴性对照组和pshRNA-survivin-387转染组，常规制备细胞爬片后用体积分数0.95乙醇室温固定10～15 min,体积分数为0.03 H2O2封闭内源性过氧化物酶，加兔抗人survivin一抗（1∶60稀释）37 ℃孵育2 h,然后再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育15 min,DAB显色、苏木精复染后树胶封片，显微镜下观察并照相。用Image Plus图像分析软件对结果进行分析，以积分光密度(IOD)值表达免疫组化阳性信号的强度,IOD 值越大,survivin 阳性越强; IOD 值越小,survivin阳性则越弱。
1.2.5 MTT 法检测转染后HepG2细胞增殖水平将HepG2细胞分成3组, 分别为实验组、空白对照组及阴性对照组, 接种于96 孔培养板,分别培养12、24、36、48和72 h,每组设6 个复孔,培养后每孔加入10 μL MTT(5 g/L，用无血清RPMI 1640配制,过滤除菌) 置于37 ℃培养箱中继续培养4 h后终止培养, 每孔加入DMSO溶液150 μL,充分振荡10 min, 使结晶充分溶解，酶标仪检测490 nm处各孔吸光度(A)值并记录,以其作为细胞增殖水平。
1.3 统计学分析
使用SPSS 11.5统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 转染效率
pshRNA-survivin-323、pshRNA-survivin-387和pshRNA-survivin-52质粒分别转染HepG2细胞后48 h，荧光显微镜下可以清楚地观察到绿色荧光, 转染效率为50%～60%。
2.2 有效shRNA表达载体的筛选
RT-PCR电泳结果显示，在156 bp处见扩增条带（图1）。表明转染48 h后各组HepG2细胞survivin mRNA水平有不同程度下调。与空白和阴性对照组比较，pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平明显下调, 差异有显著性（F=18.64,q=4.293～4.925,P<0.05）；而pshRNA-survivin-323和pshRNA-survivin-52转染组差异无显著性（P＞0.05）。见表1。
图1 RT-PCR电泳检测各组HepG2细胞survivin mRNA的表达
①空白对照组;②阴性对照组;③pshRNA-survivin-52转染组;④pshRNA-survivin-387转染组；⑤pshRNA-survivin-323转染组；⑥空白对照组;⑦阴性对照组；⑧pshRNA-survivin-52转染组;⑨pshRNA-survivin-387转染组；⑩pshRNA-survivin-323转染组;M为DNA Marker (DL2000)表1 转染48 h后各组HepG2细胞survivin mRNA的表达水平与空白对照组和阴性对照组比较，F=18.64,*q=4.293～4.925，P<0.05
2.3 各组survivin蛋白表达比较
显微镜下见HepG2细胞胞浆或胞核中有survivin蛋白表达，呈棕黄色颗粒沉着。转染48 h后，空白对照组、阴性对照组以及pshRNA-survivin-387转染组survivin蛋白的表达强度分别为1.15±0.05，1.10±0.06，0.78±0.04，pshRNA-survivin-387转染组细胞survivin蛋白表达较其他两组明显下降（F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01）,而阴性对照组与空白对照组比较差异无显著意义（q=2.13,P>0.05）。2.4 转染后不同时间HepG2细胞增殖的变化
pshRNA-survivin-387转染组HepG2细胞的增殖水平在不同时间点均显著低于空白对照组和阴性对照组(F=20.06～47.65,q=11.186～12.601,P<0.01)。而空白对照组和阴性对照组之间差异无显著性(P>0.05)。见表2。表2 转染siRNA 后不同时间各组HepG2细胞A值比较(n=6,A,±s)与空白对照组和阴性对照组相比较，F=20.06～47.65,*q=11.186～ 12.601，P<0.01
3 讨 论
survivin是IAP家族中的一个重要成员，是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子。王滋宗等［2］实验结果证实，caspase-3基因的表达与survivin基因表达具有显著负相关性，说明survivin与抑制肿瘤细胞的凋亡有关。近年来的实验研究显示，survivin在肝癌组织中大量表达。MORINAGA等［3］研究证实了survivin基因高表达与肝癌的发生密切相关。因此，靶向封闭survivin可诱导肝癌细胞凋亡,并抑制细胞增殖,从而抑制肿瘤细胞生长［4］。RNAi是自然界生物体的一种遗传现象,其主要是利用双链RNA 特异性介导其互补同源mRNA 序列的降解。根据这一生理机制，依照靶基因mRNA设计序列特异性siRNA，可以起到封闭特异性基因表达的作用。本课题欲通过RNAi下调survivin 基因的表达以治疗肝癌，利用构建的shRNA 真核表达载体转录产物可在体内首先形成由一个茎环所分离的具有反向重复序列的shRNA,此shRNA 随后被加工成siRNA 而降解目的基因mRNA 表达。这种方法克服了人工合成的siRNA成本高、费用大以及在体内作用时间短的缺点，显示了其优越性。
肝细胞癌在我国消化系统恶性肿瘤的发病率较高，传统临床治疗的中远期疗效均不理想,因此寻找更为有效的治疗手段至关重要。本研究通过转染荧光标记的shRNA表达载体了解转染效果，并观察其特异性抑制内源目的基因survivin 的作用。结果显示，pshRNA-survivin-387 能有效地降解HepG2细胞内mRNA, 使mRNA 水平下降,而pshRNA-survivin-323和pshRNA-survivin-52对survivin 基因的表达无影响，表明该载体介导RNAi有survivin 基因特异性，同时证明针对靶基因不同位点所设计的siRNA在诱导RNAi作用效力是不同的,即使针对同一靶基因,序列位置不同抑制效果也不同,这可能与靶基因mRNA二级结构有关。因此，我们选择最有效的pshRNA-survivin-387表达载体用于后续实验，其抑制HepG2细胞survivin 基因表达后, HepG2 细胞的增殖水平在不同时间点均显著低于对照组，表明RNAi可以特异性抑制HepG2 细胞survivin 基因的表达, 能有效地降低HepG2 细胞增殖水平, 诱导细胞凋亡，这与段瑞红等［5］研究结果一致。因此，本实验为pshRNA-survivin抑制肿瘤细胞内源survivin基因的表达从而介导肿瘤细胞的凋亡提供了可行性方案。 另外，如何提高肝癌细胞对放化疗敏感性也成为研究热点。目前国内外均有研究表明,抑制survivin表达能增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性［6］。王颖等［7］研究显示，siRNA转染后的肝癌细胞对化疗药物氟尿嘧啶和DDP的敏感性明显增加。但本文未涉及药物敏感性，对此尚有待于进一步研究。
【参考文献】
［１］BEIERLE E A, NAGARAM A, DAI W, et al. VEGF-mediated survivin expression in neuroblastoma cells［J］. J Surg Res, 2005,127(1):21-23.
［2］王滋宗,魏煜程,沈毅,等. 非小细胞肺癌组织Survivin 和Caspase 基因表达及其关系［J］. 青岛大学医学院学报, 2008,44(4):319-321.
［3］MORINAGA S, NAKAMURA Y, ISHIWA N, et al. Expression of survivin mRNA associates with apoptosis, proliferation and histologically aggressive features in hepatocellular carcinoma［J］. Oncol Rep, 2004,12(6):1189-1194.
［4］FIELDSAC, COTSON IS G, SEXTON D, et al. Survivin expression in hepatocellular carcinoma: correlation with proliferation, prognostic parameters, and outcome［J］. Mod Pathol, 2004,17(11):1378-1381.
［5］段瑞红,闫歌,公茂庆,等. siRNA 腺病毒抑制Survivin 基因表达诱导肝癌细胞凋亡［J］. 中国病原生物学杂志, 2007,2(5):321-325.
［6］NAKAO K, HAMASAKI K, ICH IKAWA T, et al. Survivin downregulation by siRNA sensitizes human hepatoma cells to TRA IL-induced apoptosis［J］. Oncol Rep, 2006,16(2):389-394.
［7］王颖,蔡钢祥,吴亮,等. 靶向Survivin基因siRNA诱导肝癌细胞凋亡的实验［J］. 医药导报, 2006,25(7):648-651.
作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003