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1 材料与方法
1.1 标本采集 55例食管癌患者均经病理科确诊,其中男39例,女16例,年龄36~83岁,平均年龄64.3岁。取术前外周静脉血3ml,另取27例非肿瘤病人(反流性食管炎14例、腐蚀性食管灼伤2例、贲门失弛缓症9例、食管憩室2例)和10例正常健康捐献者的外周血3ml,作为阴性对照。均于2h之内用Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,-70℃冻存。以10例食管癌患者手术中取得的新鲜肿瘤组织标本作为阳性对照。
1.2 试剂 Ficoll和Trizol试剂均为南京生兴生物技术有限公司产品;一步法RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 RNA的提取 Trizol一步法进行细胞和组织总RNA的抽提。
1.3.2 引物设计及合成 自行设计MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19、CEA和内参照β-actin这6种基因mRNA引物,并合成,序列见表1。
表1 引物序列和扩增片段长度(略)
1.3.3 一步法RT-PCR扩增 PCR反应体积为50μl,Mg离子浓度为5mmol/L,dNTP浓度为1mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,加上5U的AMV逆转录酶和5U的DNA Taq酶,于PTC-200型PCR仪内扩增,条件为50℃延伸15min,94℃2min,94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s,进行40个循环,最后一个循环结束后,72℃延伸5min。
1.3.4 RT-PCR产物鉴定 加样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,紫外光凝胶成像系统扫描。且产物经过纯化后进行 DNA序列测定。
1.4 临床资料收集 收集全部患者的性别、年龄、肿瘤大小、细胞分化程度、组织病理学类型、浸润深度、临床病理分期、淋巴结转移及远处转移情况。本实验将患者按照这些临床资料进行分类列表探讨基因表达规律。根据年龄分为≤60岁、>60岁两组;肿瘤大小按<5cm、≥5cm分类;按病理形态将肿瘤分化程度分为高(分化良好)、中(分化中等)+低(低、未分化)两大类;浸润深度按TNM分期法分为T 1 ~T 2 和T 3 ~T 4 两栏进行比较。临床病理分期根据1987年国际抗癌联盟UICC制定的国际TNM标准,按0~Ⅱ和Ⅲ~Ⅳ两栏讨论。
1.5 统计学分析 用STATA软件分析各组数据,采用χ 2 检验及Fisher确切概率法,以P<0.05为显著性差异。
2 结果
2.1 RT-PCR产物验证 扩增产物进行DNA序列测定,结果证实所得的产物的确为所要扩增的目的基因。
2.2 5种基因在食管癌患者外周静脉血以及对照组的表达 MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因的阳性率分别为25.45%(14/55),47.27%(26/55),49.09%(27/55),34.55%(19/55),52.73%(29/55),联合检测时,阳性表达率为72.73%(40/55);在正常健康捐献者外周血中有3例CEA阳性,在非肿瘤病人外周血中有3例CK20阳性(2例为反流性食管炎患者,1例为腐蚀性食管灼伤患者),3例CK19阳性(腐蚀性食管灼伤、贲门失弛缓症、食管憩室各1例),3例CEA阳性(3例均为反流性食管炎患者),在10例食管癌组织中均为阳性。内参照β-actin全部阳性表达(图1)。
图1 β-actin和五种基因R T-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果(略)
2.3 5种基因的表达与临床病理的相关性分析 见表2。
表2 5种基因的表达情况与肿瘤转移相关性分析(略)
注:有转移组与无转移组相比较, * P<0.05, ** P<0.01
3 讨论
食管癌是一种常见的恶性肿瘤,早期食管癌发展成晚期浸润癌,通常需要2~3年,甚至更长时间;个别病例甚至可“带癌生存”达6年以上,如能早期发现诊断清楚,可手术根治。因此探求高特异性的肿瘤转移潜力和临床预后的预测指标,并探讨高敏感的检测手段以指导临床综合治疗已成为临床肿瘤研究的特点。
CD20、CK19、CEA是国内外公认的、最常见的上皮性恶性肿瘤标志物,hSTC-1T和MAGEA3是近来才发现可以用于检测微转移的肿瘤标志物。本实验结果显示MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因的阳性率分别为25.45%,47.27%,49.09%,34.55%和52.73%。在正常健康捐献者外周血中有3例CEA阳性,在非肿瘤病人外周血中有3例CK20阳性(2例为反流性食管炎患者,1例为腐蚀性食管灼伤患者),3例CT19阳性(腐蚀性食管灼伤、贲门失弛缓症、食管憩室各1例),3例CEA阳性(3例均为反流性食管炎患者),而在10例食管癌组织中MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19、CEA均为阳性。提示上述靶基因的表达(除CK19以外)与食管癌有很强的相关性,这与国内外的相关报道有类似之处。Inoue H [1] 等运用RT-PCR方法最早分析了食管癌组织中MAGE基因的表达情况,42例食管癌组织中有24例(57%)表达MAGEA3,而42例正常食管组织中无一例表达MAGE基因。Quillien V [2] 等研究显示49例食管鳞状细胞癌有23例(47%)表达MAGE-3,但是MAGE基因的表达与食管癌的位置、分化程度、TNM分期无关。Fujiwara [3] 等应用RT-PCR技术和半定量PCR技术分析得出,hSTC-1在肿瘤组织和各种肿瘤细胞中的表达远高于正常组织;4例(36.4%)肿瘤患者外周血中的hSTC-1mRNA表达,而在非肿瘤患者外周血中完全不表达。吴平平 [4] 等用RT-PCR方法检测发现食管癌患者的外周血中hSTC-1mRNA的阳性率为52.9%(9/17例),12例消化道恶性肿瘤组织中的阳性表达率为100%,而12例健康成人、4例妊娠期妇女、14例消化道炎症疾病患者外周血中无一例出现阳性。且外周血中的hSTC-1mRNA的表达与肿瘤的浸润深度、临床病理分期、淋巴结转移有显著相关性。Nakashima S [5] 等收集了54例食管鳞状细胞癌患者手术前、肿瘤切除前和肿瘤切除后三个时期的外周动脉和静脉血,用RT-PCR方法分析CEA mRNA的表达。结果31例患者有CEA mRNA表达,且肿瘤切除后收集的外周血CEA mRNA表达率高于其他两个时期,CEA mRNA表达阳性的患者肿瘤复发率和血液转移率也高于阴性表达者。本实验结果与上述报道相一致。
本研究联合应用5种肿瘤标志物,对食管癌患者的外周血中肿瘤细胞的检出率较单一指标确有显著性提高,阳性检测率可提高到72.73%,且阳性表达率与肿瘤的转移有相关性。提示多基因联合可有效避免单一指标造成的遗漏,可以作为一种检测外周血循环肿瘤细胞的有效方法,有助于在临床肿瘤转移形成以前做出诊断、并指导术后化疗的有效实施,进一步支持了我们以前的研究成果 [6~8] 。值得进一步探究。
参考文献
1 Inoue H,Mori M,Li J,et al.Human esophageal carcinomas frequently express the tumor-rejection antigens of MAGE genes.Int J Cancer,1995,15;63(4):523-526.
2 Quillien V,Raoul JL,Heresbach D,et al.Expression of MAGE genes in esophageal squamous-cell carcinoma.Anticancer Res,1997,17(1A):387-391.
3 Fujiwara Y,Sugita Y,Nakamori S,et al.Assessment of Stanniocalcin-1mRNA as a molecular marker for micrometastases of various human can-cers.Int J Oncol,2000,16(4):799-804.
4 吴平平,黄培林,郭英,等.外周血人类斯钙素1(hSTC-1)基因在大肠癌中的检测.中华病理学杂志,2004,33(5):407-408.
5 Nakashima S,Natsugoe S,Matsumoto M,et al.Clinical significance of circulating tumor cells in blood by molecular detection and tumor mark-ers in esophageal cancer.Surgery,2003,133(2):162-169.
6 Huang PL,Wang J,Guo Y,et al.Molecular detection of disseminated tu-mor cells in the peripheral blood in patients with gastrointestinal cancer.J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(3):192-198.
7 王景美,黄培林,郭英.巢式RT-PCR检测胃癌患者外周血循环癌细胞的研究.实用癌症杂志,2003,18(5):467-470.
8 郭英,黄培林,王景美,等.CK19、CK20mRNA在上皮恶性肿瘤患者外周血中的表达及其意义.东南大学学报(医学版),2003,22(1):9-12.
* 基金项目:南京市科技发展计划项目,江苏省卫生厅重点资助项目(H200116)、江苏高校高新技术产业发展项目(JHB04-030)
作者单位:210009江苏南京东南大学基础医学院病理教研室(△ 通讯作者)