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【摘要】 目的 探讨充血性心力衰竭（Congestive Heart lailure CHF）患者外周血辅助性T淋巴细胞功能失调及其在心力衰竭发生及发展中的意义。方法 选择62例充血性心力衰竭患者作为实验组，并按照纽约心脏病协会（NYHA）分为心功能Ⅱ级（28例），心功能Ⅲ级（16例），心功能Ⅳ级（18例），另选30例健康志愿者作为对照组。采用流式细胞分析法，检测所有被检者外周血CD4+细胞胞内细胞因子干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）的表达。同时分离外周血单核细胞（PBMC），经植物血凝素（PHA）刺激培养后，应用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测培养上清液中IFN-γ和IL-4水平。结果 充血性心力衰竭组患者IFN-γ染色阳性的细胞占CD4+T细胞的比率为17.48%，明显高于对照组的12.09% 。IL-4染色阳性细胞比率在两组间未见显著统计学差异。ELISA检测显示心力衰竭组培养上清液中IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值明显高于对照组，而两组间IL-4水平则无显著统计学意义。结论 心力衰竭患者辅助性T淋巴细胞功能与心功能之间有一定关系，且与心功能级别呈正相关。辅助性T淋巴细胞功能失调可能参与了CHF患者的心室重构过程。
【关键词】 心力衰竭；T淋巴细胞；细胞因子；干扰素γ；白细胞介素4
The investigation of cell-mediated immunity function imbalance in patients with congestive heart failure
CHEN bing-xue,WANG Ling-ling,LIU li,et al.Department of Internal Medicine, Bethune Military Medical College, Shijiazhuang 050081, China
【Abstract】 Objective To explore the significance of cell-mediated immunity function imbalance in patients with congestive heart failure.Methods Six-two patients with congestive heart failure were included and divided into 3 groups according to the New York Heart Association (NYHA),thirty healthy men were studied as control. The heart function was evaluated by two-dimensional echocardiography. Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were collected from these patients.Cytokine-producing CD4＋ T cells were quantified by 3-color flow cytometry after bring stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) and ionomyccin. After being stimulated with PHA, the levels of IFN-γ and IL-4 in culture supernatants were measured by ELISA.Results The frequencies of IFN-γ-producing T cells were found to be significantly higher in congestive heart failure group(17.48%) than that in control group(12.09%). There was no significant difference on the frequencies of IL-4-producing peripheral T-lymphocytes between the two groups. The IFN-γ level and the ratios of IFN-γ/IL-4 in congestive heart failure group were significantly higher than that of control. While there was no significant difference in IL-4 level between the two groups.Conclusion The cell-mediated immunity function was associated with heart function in patients with congestive heart failure. The up-regulation of T cell function was consistent with poor heart function, suggesting that cell-mediated immunity function imbalance may participate in ventricular remodeling after heart failure.
【Key words】 heart failure;T-lymphocytes;cytokines;interferon-gamma;interleukin-4
随着人口老龄化，高血压及冠心病等心血管疾病急性病死率显著降低，作为大多数心血管疾病的最终转归-充血性心力衰竭 (Congestive heart failure, CHF)日益成为严重威胁人类健康的重大公共卫生问题。积极探讨CHF的发生发展机制 ,可为CHF的防治提供强有力的理论指导。在过去的30年中，由于心力衰竭治疗学的深入进展，心力衰竭的病死率虽已明显下降；但仍有资料显示，心力衰竭的发病率仍未得到有效控制，CHF患者在心血管疾病入院治疗的比率中仍占到1/4以上［1］。最近的研究证实，受损的心脏可以释放或暴露正常隐蔽的抗原成分，从而触发针对心肌细胞的自身免疫应答反应，导致心室重构和心肌进一步损伤。辅助性T淋巴细胞功能失衡被认为与自身免疫性疾病的发病有密切关系［2］。本研究通过对CHF患者外周血辅助性T淋巴细胞功能检测，探讨辅助性T淋巴细胞功能失调在CHF发生与发展过程中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象 收集自2004年1月～2005年10月在我院住院的CHF患者62例，其中男44例，平均年龄（62.43±2.8）岁，女18例，平均年龄（58.32±8.4）岁；按美国纽约心脏学会（NYHA）心功能分级标准，Ⅱ级28例，Ⅲ级16例，Ⅳ18例；其中冠心病38例，风湿性心脏病18例，扩张性心肌病6例。均无急慢性感染、免疫系统疾病、恶性肿瘤、风湿活动及半年内急性心肌梗死。各级心力衰竭组年龄、性别、病种比较差异无显著性。对照组：选择性别、年龄与实验组相匹配的健康人30例，男18例，女12例，年龄(56.3±6.8)岁。均为经询问病史、体格检查及常规辅助检查排除器质性疾患的健康人。 有以下情况均剔除：合并脑卒中、严重的肝肾功能不全者；周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者；恶性肿瘤患者和风湿性疾病患者。此外，合并感染性疾病如：败血症、严重的上呼吸道感染、肺部或肝胆道感染等、高热以及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等均予以剔除。
1.2 研究方法
1.2.1 标本收集 每例CHF患者于住院后静脉采血5ml，2ml用于流式检测，3ml用于细胞培养，肝素钠抗凝。
1.2.2 流式细胞内细胞因子检测 取两只试管，分别为测定管和阴性对照管。每管加入肝素抗凝全血100μl和RPML-1640培养基础100μl。加入刺激剂佛波乙醇酯（PMA）25ng，离子霉素(ionomycin)1μg和蛋白质转运抑制剂莫能霉素(monensin)4μl。37℃5%二氧化碳培养箱5h。混匀，各取100μl。均加入5PE-cy5标记的鼠抗人CD4＋单抗。4℃避光孵育20min。加1ml溶血素裂解红细胞，室温10min，离心弃上清，PBS洗涤1次。加入500μl破膜剂进行细胞打孔利于细胞因子单抗进入细胞，离心弃上清后进行胞内细胞因子染色。测定管中加入5μl FITC标记的IFN-γ/PE标记的IL-4单抗，对照管加入相应的荧光标记对照抗体，4℃避光孵育20min,PBS洗涤一次后上机检测。上述主要试剂均购自BD公司。应用流式细胞仪FACSCALIBUR型。根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，对第一通道和第二通道分别以相应的同种型IgG染色细胞为阴性对照，设置各通道之间的荧光补偿后，对CD4+细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4进行检测。
1.2.3 酶联免疫吸附方法（ELISA）细胞因子检测 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,用含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞浓度为1.5×106/ml，加入植物血凝素（PHA）100mg/L,37℃,5%CO2培养箱培养48h后，收集上清储存于－20℃用于细胞因子检测。采用ELISA方法，所用操作步骤均按照说明书进行。干扰素γ（IFN-γ）和白介素4（IL－4）检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司，IFN-γ最低检测值15.625ng/L,IL-4最低检测值8ng/L。
1.3 统计学方法 所有资料均以(x±s)表示，应用SPSS 11.0软件进行统计学分析。作方差齐性检验（levene检验），方差分析（F检验），多个均数间的两两比较用q检验，以P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者临床资料的比较 对照组和CHF组患者的年龄、性别和冠心病危险因素差异均无统计学意义。其中对照组男18例，女12例，合并高血压9例，合并高脂血症7例。心力衰竭组男44例，女18例，合并高血压31例，合并高脂血症16例，合并糖尿病9例。CHF患者与对照组临床资料的比较见表1。
表1 CHF患者与对照组临床资料的比较 (略)注：与对照组比较，*P＞0.05；TC：总胆固醇；LDL－C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL－C：高密度脂蛋白胆固醇；TG：甘油三酯
2.2 CHF患者与对照组心功能指标的比较 与对照组相比，心力衰竭组患者出现明显的左室扩张和收缩功能受损（表2），表现为左室舒张末期直径（LVEDd）明显增大，左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）显著降低。
表2 CHF患者与对照组心功能的比较 (略)注：与正常对照组比较，*P＜0.05
2.3 CHF组与对照组CD4＋细胞胞内因子的表达 二者的差别见表3。
表3 CHF组与对照组CD4＋细胞（略）注：与正常对照组比较，*P＜0.05
与对照组比较，CHF组患者的IFN－γ染色阳性的细胞占CD4＋细胞的比例明显增高，而IL-4染色阳性细胞比例在两组间差异无统计学意义。
2.4 CHF组与对照组PBMC培养上清液中IFN-γ及IL-4浓度差别 见表4。
表4 CHF组与对照组PBMC培养（略）注：与正常对照组比较，* P＜0.05
与对照组比较，CHF组患者的PBMC培养上清液中Th1型细胞因子-IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值明显增高，而Th2型细胞因子IL-4水平在两组间差异无统计学意义。
3 讨论
在CHF的发生发展中，除了通过Frank-Starling机制和神经体液装置的过度代偿机制外，心室重构是其主要病理学机制［3］。自身免疫所致的炎症性反应在心室重构过程中的作用正日益受到学者的关注。有学者观察到在CHF的大鼠模型中，大鼠心肌有大量淋巴细胞浸润和血管周围炎，说明大鼠体内发生了细胞免疫应答为主的自身免疫反应［4］。T淋巴细胞在自身免疫性炎症中起重要作用。现代免疫学认为，活化的辅助性T淋巴细胞按其功能和分泌细胞因子的不同至少可以分为两群：Th1细胞可以分泌IFN-γ而不分泌IL-4，主要介导细胞免疫应答；Th2细胞可以分泌IL-4而不分泌IFN-γ，主要介导体液免疫应答，通常以这两种细胞因子作为鉴别Th1和Th2的标志［5］。ELISA方法对PBMC群体一段时间内释放细胞因子总和进行检测，而三色法流式细胞术检测胞内细胞因子在单个细胞水平区分Th1/Th2细胞，两者均可作为分析Th1/Th2亚型的依据［6］。Th1/Th2细胞出现功能失衡和自身免疫性疾病的发生发展有密切关系。Th1细胞功能亢进可促进某些器官特异性自身免疫病，如1型糖尿病的发展；Th2细胞功能亢进可促进全身性自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮的发展。研究中我们发现CHF患者体内出现Th1细胞功能明显高于对照组，表明其功能亢进，而且持续时间较长，提示该功能亢进可能继发于CHF后的心肌炎症反应，并推测CHF患者Th1细胞功能亢进可能是CHF病理性自身免疫应答的发生机制之一，参与CHF和心室重构过程。本研究还发现，CHF患者的Th细胞功能与心功能有一定关系，Th1细胞功能与心功能等级呈明显正相关，表现为IFN-γ染色阳性的细胞占CD4＋T细胞的比例以及PBMC培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值的明显增高，提示Th1细胞功能亢进对CHF后心力衰竭的发生发展有促进作用。本研究尚存在一些不足之处。首先，本试验样本数较少，尚需要更大规模的临床试验予以证实；其次，本试验未对CHF患者进行动态Th细胞功能与LVEDd关系的监测。今后的研究将弥补上述不足之处，并致力于通过对Th亚群功能的干预来延缓CHF心室重构和心力衰竭的进程。
【参考文献】
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(编辑：宋 冰)
作者单位： 050081 河北石家庄，白求恩军医学院内科教研室
050000 河北石家庄，河北医科大学第二临床医学院心内科
050041 河北石家庄，白求恩军医学院附属260医院心内科