TGFβ1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究

　　摘  要：［目的］评价在TGFβ1干预下的兔间充质干细胞移植到兔退变椎间盘后是否可诱导向髓核细胞分化并增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量。［方法］采用体外细胞培养技术，将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和培养，成功传代、纯化后并在TGFβ1干预下植入兔退变椎间盘的模型中。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化；免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化。所得数据经SPSS 115统计学软件进行统计学处理。［结果］原代培养及传代培养显示兔骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力，并且8周内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量的恢复实验组对比模型组增高明显，统计学显示差异有显著性意义。［结论］将TGFβ1干预下的兔间充质干细胞移植到退变椎间盘后可以在一定时间内增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，从而延缓椎间盘退变。

    关键词：骨髓间充质干细胞；  椎间盘；  转化生长因子β1（TGFβ1）；  髓核细胞

     Intervertebral disc cell therapy for regeneration:mesenchymal stem cell cultivation in vitro and intervention in TGFβ1 implantation in rabbit intervertebral discs∥ZHAO Ziru,WU Xiaotao,QI Yabin,et alDepartment of Orthopaedics,Zhongda Hospital of Southeast University,Nanjing 210009,China

    Abstract：［Objective］To evaluate whether transplanted marrow mesenchymal stem cells interfered in TGFβ1 can differentiate to nucleus pulposus cells and increase the amount of proteoglycan and collagenase Ⅱ content in intervertebral discs［Method］We used an in vivo model to investigate the feasibility of marrow mesenchymal stem cells that cultured in vitro and interfered in TGFβ1 delivery,retention,and survival in the degeneratived disc spaceIn 2,4,6,8 weeks we used immunohistochemical staining to determine the change of collagenase Ⅱ content;spectrophotometry to determine the change of amount of proteoglycan with Phlorglucinol;the experiment date were analyzed by SPSS 115 soft ware［Result］We found MSCs could maintain viability and proliferate within the rabbit inter vertebral discThe amount of proteoglycan and collagen Type Ⅱ content of the intervertebral in matrix synthesis in the experiment group was increased in 8 weeksWe found no changes in the modle group［Conclusion］Our data suggest that transplanted marrow mesenchymal stem cells in vivo can survive and increase proteoglycan and collagen Type Ⅱ amount interfered in TGFβ1 in some periods,which support its potential use as a treatment of intervertebral disc degeneration

    Key words：Marrow mesenchymal stem cells（MSCs）;  Inter vertebral disc;  TGFβ1;  Nucleus pulposus cell

    椎间盘退变所引发的腰腿痛是临床常见病，其主要病理变化为髓核组织中Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量减少。近年来随着对干细胞研究的逐渐深入，将干细胞的定向诱导分化与组织工程的方法结合起来即治疗性克隆（therapeutic cloning）概念的提出为许多疾病的治疗指明了研究方向〔1〕。本研究旨将培养的间充质干细胞在TGFβ1干预下注射到椎间盘退变模型后观察其体内是否可诱导向髓核细胞分化，增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，从而延缓椎间盘退变。

    1  材料和方法

    11  材  料

    111  主要试剂及仪器

    LGDMEM培养基（美国Gibco公司）、100%胎牛血清（杭州四季青生物研究所）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）、Percoll（美国Pharmacia公司，比重1077 g/L）、15 T磁共振仪（Philip公司，Eclipse机型）、台盼兰试剂（美国Sigma公司）、倒置荧光相差显微镜（德国Zeiss公司）、5%CO2细胞培养箱（德国Herabus公司）、数码照相机（日本Nikon公司）、透明质酸钠（山东正大福瑞达）、TGFβ1（PeproTech ECLTD）、AntiCollagenTypeⅡ（Ab1）（CALBIOCHEM LTD）、SABC免疫组化试剂盒（广州中杉）、DAB显色试剂盒（广州中杉）、一次性培养瓶、培养板（Corning）。新西兰大白兔由东南大学医学院动物中心提供。共30只，体重22~30 kg。

    12  方  法

    121  细胞培养方法

    1211  兔骨髓间充质细胞的分离培养

    取2个月龄新西兰大白兔6只，雌雄不拘，平均体重22 kg（20~24 kg）；3%戊巴比妥钠按1 ml／kg的剂量施以全身麻醉另用1%利多卡因于手术部位（双侧髂骨及胫骨）施以局麻；无菌操作下于双侧胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2~3 mm的孔使通达髓腔；用18号骨穿针接10 ml注射器，内含3 000 U／ml的肝素01 ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔抽出骨髓血约2 ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤2次后，离心800 r/min，5 min；弃去上清液，沉淀用LGDMEM培养液重新打匀；制成单细胞悬液，将单细胞悬液缓慢加入预先加有密度为1077 g／L的Percoll单核细胞分离液的离心管中,2 000r/min，离心20 min，吸取中间的白膜层，用PBS冲洗2次后，离心800 r/min，5 min后以2×105／ml密度接种于20%胎牛血清的LGDMEM+TGFβ1（1 ng／ml）〔3〕培养基，置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱。4~5 d首次换液，以后每3 d换液1次，逐次递减血清浓度，直至为10%。倒置显微镜下逐日观察细胞形态并拍照记录。8~12 d细胞生长融合达90%以上，以025%胰蛋白酶消化，按1传2比例分瓶接种传代培养。此为传一代，记为P1，以此类推，分别获取P2、P3、P4……P10代间充质干细胞。以P6代细胞作为注射用。

    1212  骨髓间充质细胞贴壁率检测

    制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106／ml,接种于5块6孔板中，每一时相接种6孔，每孔2 ml，按上述条件培养。分别于接种后4、8、12、20、24h各取出1块培养板计算细胞数。吸去培养液，用01 MPBS漂洗除去未贴壁细胞，025%胰酶消化后离心收集细胞，进行细胞计数，按下列公式计算贴壁率：

    贴壁率=贴壁细胞总数／接种细胞总数×100%

    122  模型手术方法

    1221  纯种成年新西兰大白兔16只,雌雄不限,全麻下采用腰椎侧前方倒八字手术入路，于腹膜外进入腰椎的侧前方,找到腰椎间盘,于L2、3、L3、4、L4、5,用21号针头针刺抽吸椎间盘，抽吸出的髓核组织湿重约52~74 mg，并立即在显微镜下观察以确定只有髓核组织。后在每个相应椎间盘旁的腰大肌处以黑色缝合线做标记,用于以后取样观察。然后冲洗、止血，依次逐层关闭切口。术后每日定期观察切口情况。术后7、15 d予以MRI检查，观察椎间盘T2信号的变化情况（图1~2）。

    1222  模型组手术2周后随机取8只作为实验组依同上法手术进入后辨认相应椎间盘，实验组注射间充质干细胞悬液+透明质酸钠20 μl，对照组注射001 mol／L的磷酸缓冲液（PBS）20 μl。仍在每个注射后的椎间盘旁的腰大肌处以黑色缝合线做标记，用于以后取样观察，然后冲洗、止血，依次逐层关闭切口。术后每日定期观察切口情况。

    123  蛋白多糖含量测定方法

    将实验组、模型组、对照组随机分为2、4、6、8周组4个亚组，每组2只兔；在相应时间于兔耳缘静脉注射空气10 ml处死，立即取出兔腰椎并辨认原椎间盘定位标记，确认3组相应椎间盘。采用间苯三酚分光光度法〔2〕，测定光密度值，转换为量值作蛋白多糖含量的测定。

    124  病理学检测方法

    分别于手术后2、4、6、8周采用兔耳中央静脉注射空气10 ml的方式，迅速处死动物，立即取出腰椎并辨认原椎间盘注射标记，取出相应椎间盘后置10%中性福尔马林保存，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色。免疫组化检测（SABC法），一抗为鼠抗兔抗Ⅱ型胶原的单克隆抗体（1∶100），二抗为生物素化鼠抗鼠IgG多克隆抗体（1∶500），DAB显色。免疫组化结果判断：阳性细胞间质呈棕黄色。应用LeicaQ550 IW计算机图像分析系统及其软件CLeicaQwinPro22）定量评价呈阳性免疫染色的髓核细胞间质的灰度值（灰度分级0~255级，0级为最深，255级为最浅），每只兔取4张切片，每组共8张，每张切片随机采集4个高倍视野进行测定（×200，向同一个方向移动切片，不重叠，不重复）。测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值。

    125  统计学方法

    将所得数据以均数±标准差x-±s表示，并输入SPSS 115统计学软件进行统计学处理。2、4、6和8周的实验组、模型组与对照组3组间先进行单因素方差分析，再行两两q检验。

    2  结  果

    21  兔骨髓MSCs原代培养的生长分析

    兔骨髓MSCs的形态学变化：原代接种培养中,可见细胞为分散、克隆集落方式增殖：第1 d贴壁细胞呈圆形或卵圆形，贴壁细胞以大小相对均匀的圆形细胞为主，其间混有少许小圆形细胞，散在存在；第3~7 d贴壁细胞明显增多，此期为MSCs生长的潜伏期，此期主要为MSCs的贴壁生长阶段，培养细胞的有丝分裂活动不甚活跃；细胞逐渐伸张为多角形或梭形，并渐有集落形成；第8 d开始，相差显微镜下可以观察到贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克隆，说明此时细胞的有丝分裂活动开始变得活跃起来；第8~10 d这些细胞克隆进一步扩大，许多细胞克隆彼此相连，细胞生长曲线显示此阶段细胞数目呈指数级递增，此期为MSCs原代培养生长的对数增殖期；第11~13 d细胞克隆彼此相连并铺满整个培养孔底面的大部分，相邻集落融合成片达80%以上，很快胞体延展呈梭形，随着细胞迅速增殖细胞排列呈漩涡状或栏栅状，细胞呈栅栏状、漩涡状排列细胞间的界限不清。细胞生长曲线显示MSCs生长进入一个平台期；第14 d贴壁生长的MSCs开始铺满整个培养孔底面，原代培养结束。传代后，细胞不以集落形式生长，而是均匀分布长梭形细胞平均生长。倒置显微镜每日观察细胞生长情况及形态特点,拍照记录（图2~3）。

    骨髓间充质干细胞的贴壁率：传代4次后2 h即有的细胞贴壁，随着时间延长，贴壁的细胞继续增多，到24 h细胞基本完全贴壁。贴壁率达到了99%（表1）。

    22  髓核组织蛋白多糖含量的测定结果（表2）表1  24 h内间充质干细胞的贴壁率实验组、对照组和模型组间蛋白多糖测定值经方差分析，P＜001,差异有显著性，各组间再行两两q检验。2和4周3组两两之间，P＜001,差异有显著性意义，6和8周实验组与对照组间，P＞005,差异无显著性意义，实验组与模型组及对照组与模型组间，P＝001。差异有显著性意义。

    23  病理学检测结果

    实验组髓核组织间质呈强阳性，4周组即显示强阳性染色，6、8周组仍呈较明显的阳性反应。对照组呈阳性反应，模型组及呈阴性或弱阳性反应（图4~6）。术后2、4、6、8周，实验组、对照组和模型组间测定值经方差分析，P＜001,差异有显著性，各组间再行两两q检验。2和4周3组两两之间，P＜001,差异有显著性意义，6和8周实验组与对照组间，P＞005,差异无显著性意义，实验组与模型组及对照组与模型组间，P＜001。差异有显著性意义（表3）。

    表3  不同时期各组髓核组织间质Ⅱ型胶原定量分析（x-±s/100 mg,n=12）

    时间（周）     实验组     对照组     模型组2     14824±287     14089±143     15087±1554     14190±166     14132±144     15223±1906     14182±105     14223±173     15087±1558     14056±054     14080±118     15129±1093  讨  论

    椎间盘退变的发生、发展的过程是缓慢而又复杂的，具体的病理生理机理目前尚未完全清楚。椎间盘细胞是高度分化的细胞，细胞的分裂极不活跃。椎间盘组织基本处于无血运状态，其细胞的营养主要途径来自渗透作用。髓核源于胚胎期的脊索，髓核细胞在胚胎期为脊索细胞，在正常成人主要以软骨样细胞为主〔4〕。髓核细胞主要表达具有软骨表型特征的蛋白多糖和Ⅱ型胶原，蛋白多糖是构成椎间盘髓核组织主要的基质成分，因此当蛋白多糖含量减少，髓核中Ⅱ型胶原含量降低时，退变随之发生〔5〕。基于对椎间盘组织退变机理的认识，目前的研究把焦点集中在椎间盘细胞,尤其是终板软骨细胞和髓核细胞上，因为只要激活椎间盘细胞，改善细胞外基质,就可能在一定程度上缓解甚或逆转椎间盘组织退变的发生。

    目前用于椎间盘组织工程的支架主要是含有胶原和透明质酸成分的基质材料。胶原是细胞之间连接的支架,透明质酸的存在可以作为蛋白多糖附着点，使蛋白多糖的沉积增加，有足够大的孔率允许种子细胞的长入〔6〕。本实验选用透明质酸作为间充质干细胞的载体植入到椎间盘内，发现其对防止粘连及支撑和防止干细胞逸出都起到了很好的作用，并且无炎症反应。但干细胞在支架内的具体作用机理还有待于进一步研究。

    骨髓间充质干细胞体外培养的软骨形成已有实验报道〔7〕。Diduch等在MSCs中加入条件培养液后,糖胺多糖和Ⅱ型胶原表达阳性，这两种指标是软骨细胞分化的标志,表现出了软骨细胞的生物学特性〔8〕。而且间充质干细胞与髓核细胞共同培养，结果显示间充质干细胞可促进髓核细胞增殖及基质合成及在椎间盘环境中有良好的增殖能力。研究结果显示了间充质干细胞转化为髓核细胞潜能的原始证据〔9〕。本实验在其基础上将分离培养并纯化的间充质干细胞移植到诱发兔椎间盘退变的模型中，进一步观察体内在活体椎间盘微环境的诱导下间充质干细胞的转化及增殖情况，也为进一步的临床试验奠定基础。

    MSCs经体外诱导培养扩增后可得到一定数量的软骨细胞。并且可以大量扩增,从量上能满足临床需要，从质上要求细胞保持原有的分化潜能。但对细胞增殖是否影响其分化潜能的观点不同,报道也不多。MSCs体外单层培养20代次，扩增108倍，其细胞性状稳定,表面抗原表达无改变,干细胞特征明显。每代均能保持软骨分化能力〔10〕。随时间的进一步延长，MSCs的软骨生成量减少,其机理有待进一步的探讨。基于上述实验结果，作者选择5～7代106／ml的纯化间充质干细胞，并观察到不仅可以保持其相对的细胞密度，也可以保留其较强的细胞活性。

    大量细胞因子的发现为有目的地促进特定细胞的生物学功能提供了契机。转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）是当前研究较深入的细胞因子之一，TGFβ影响细胞外基质的合成，能诱导多种细胞合成和分泌细胞外基质蛋白，刺激胶原和其他基质成分沉积，阻断纤维蛋白酶原抑制剂，促进血管生成等〔11〕。本实验用生物化学方法检测发现，从术后2周开始实验组髓核组织中蛋白多糖的含量增加，并持续至术后8周。6周后实验组与对照组已无明显差异，这与Sakai〔12〕等的观察结果相一致。同时在免疫组化中Ⅱ型胶原的表达实验组明显高于模型组，差异有显著性意义，4周后Ⅱ型胶原的含量实验组与对照组已无明显差异；从而说明移植到兔体内退变腰椎间盘髓核组织在TGFβ1的干预下的间充质干细胞可诱导向髓核细胞分化并增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量。

    综上所述，间充质干细胞凭借其分化多向性和易于分离培养扩增等特点，不仅是很好的基础研究的实验材料，也为干细胞组织工程学提供一个很好的细胞来源和基因治疗的载体。为许多疾病的治疗开辟新的天地。希望是无限诱人的，但必须清醒地看到，干细胞的研究还刚刚处在起步阶段；组织工程在椎间盘领域的研究相对较少；生长因子的作用及其与基因治疗的联合研究目前仍不充分；细胞支架材料的选择仍有争议等，所以干细胞组织工程学的研究离真正投入临床应用还有很长的路要走。

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      （东南大学医学院附属中大医院骨科，南京  210009）