纤维蛋白胶在骨修复过程中的应用进展

【关键词】  纤维蛋白胶在骨修复过程中

　纤维蛋白黏合胶，又称纤维蛋白封闭系统或纤维蛋白胶(fibrin glue, FG/fibrinfibronectin sealing system, FFSS/fibrin sealant, FS)是一种天然的细胞外基质，因其生物相容性、可塑性良好，具有一定的弹性和黏附能力，易被组织吸收，无细胞毒性，制备方便，近年来被广泛用于骨组织工程中。现将纤维蛋白胶在骨修复治疗的新近研究进展综述如下。
   
　　1  历史渊源
   
　　纤维蛋白胶作为天然外科黏合剂的研究始于上世纪初，1909年Bergel首次利用纤维蛋白混悬液尝试用于止血。1944年，首次出现了以纤维蛋白原与凝血酶粗制品混合，用于黏合移植皮瓣的报道。70年代，随着分离、提纯技术的完善，FS得以定型并初步在临床实验性使用。80年代，德国、法国及奥地利等欧洲国家率先开发出商品化人源性纤维蛋白胶(Tisscol、Beriplast、Biocol等)并应用于临床。但人源性FS存在着传播潜在疾病、来源受限、成本昂贵等缺点。在此基础上90年代，我国科技工作者研制出动物源性的医用FS，并在临床上广泛试用，显示出良好的临床效果。目前FS的生产方法成熟稳定，作用机理、体内的转化过程和终产物都很明确，临床应用结果显示FS在止血、组织黏结、促进伤口愈合、防止组织黏连等方面效果确切。
   
　　2  纤维蛋白胶的作用机理及理化性质
   
　　纤维蛋白胶是利用哺乳类动物或人的血液中有关成分，通过人工提取而来。制剂由2部分组成：(1)浓缩纤维蛋白原，XⅢ因子和抑肽酶，其中纤维蛋白原含量与凝固的强度、止血效果、黏合力直接相关；(2)凝血酶粉及其溶解剂氯化钙。凝血酶的浓度决定了成胶的速度与时间。2部分混合后，凝血酶酶切纤维蛋白原，释放出纤维蛋白A肽及B肽，促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形成纤维蛋白单体，凝血因子XⅢ有催化聚合作用，使纤维蛋白分子交联，聚合成网状，增加凝集强度。凝血酶同时激活因子XⅢ，活性态的因子XⅢa在钙离子存在下参与纤维蛋白多肽的交联，使之形成坚固的不易降解的凝块。由于纤维蛋白胶在成型之前2种成分都是液体成分，具有可以任意塑型的特点，作为一种可注射性细胞支架材料目前已经在组织工程学领域得到广泛应用。研究已经证实：FS是一种生物相容性很好的复合物，可以促进细胞外基质的合成，促进新血管的形成，而且不会导致炎症反应［1］。
   
　　纤维蛋白胶一个重要的特性是在体内纤溶酶作用下能够在一定时间内降解吸收。通常纤维蛋白在体内的降解时间在2周左右［2］。快速的降解作用有利于组织的愈合、细胞及因子的释放［3,4,7］。但是也存在一定的问题。具有天然网状结构，长期稳定的纤维蛋白胶是细胞生长和分泌特异性基质的必要条件。如果纤维蛋白胶降解吸收过快或其纤维网状结构过于紧密会抑制细胞增殖与迁移，影响细胞外基质的形成［5］。纤维蛋白胶内不同的组成成分，如纤维蛋白原、凝血酶浓度、离子强度能够影响纤维蛋白胶的稳定性及其内部结构［6,7］。Ferry等人首先报道了2种不同类型的纤维蛋白胶：粗糙型和精细型。Fine纤维蛋白胶是由大量分支状的细纤维组成，胶体透明坚固，孔隙率较小，降解吸收时间较长。相反，Coarse纤维蛋白胶是由粗纤维组成，由于存在大量的侧枝，因此肢体混浊，松散，孔隙率大，降解吸收时间短。底物酶及其他底物浓度如pH值、溶液的离子浓度能够影响这种侧枝连接［8,9］。此外，外源性的加入纤溶酶抑制剂如抑肽酶、氨甲环酸等能够抵抗纤溶酶、胰蛋白酶等蛋白降解酶的降解作用，延长纤维蛋白多聚体存在的时间，有利于组织的修复与重建［10～12］。但是也有一些作者对于抗纤溶制剂应用持反对意见，他们认为添加纤溶酶抑制剂将会引起过敏反应、血栓形成、局部血栓性静脉炎等副作用，同时影响细胞的迁移及周围巨噬细胞、成纤维母细胞的积聚，引起异体巨细胞的出现，不利于细胞基质成分的形成［13，14］。
   
　　3  纤维蛋白胶在骨修复方面的应用研究

　　3.1  纤维蛋白胶作为细胞支架在骨修复方面的应用
   
　　临床治疗骨缺损时，常需不同形状和规格的植骨材料，如能解决材料的可塑性问题，将为临床提供极大的方便。纤维蛋白胶在这方面具有自己独特的优势。纤维蛋白胶在成型之前是液体成分，凝固后可以任意塑型并具有一定的黏弹性，可以将骨膜、骨片或无机骨替代材料黏附在一起，用于修复骨缺损。Isogai等［15］将新生牛的桡骨干骺端的骨膜取下绞碎后与FG混合植入无胸腺裸鼠背部皮下观察异位骨化情况，结果发现：实验组12周有新骨形成，单纯FG组未见新骨形成。Minamide等人［16］将自体骨片与FS混合进行骨修补，其中11例后路脊柱融合、7例前路融合和1例骨缺损修补，仅需数分钟混合物就塑成紧固移植物黏附于受体部位。所有病例均未发生有关的并发症，疗效极好。Guehennec等人［17］将纤维蛋白胶与双相磷酸钙颗粒构建成可注射型材料来修复骨缺损，结果发现单独使用磷酸钙组新骨形成出现在颗粒的表面，而联合使用纤维蛋白胶与磷酸钙组新骨则出现在距磷酸钙表面一定距离的纤维网状结构中。随后他们通过改变纤维蛋白胶中凝血酶的浓度发现这一现象是与凝血酶有关的。提高凝血酶能够改变纤维蛋白胶的纤维厚度、孔隙率及均质性；加入磷酸钙颗粒并不改变纤维蛋白胶的交联，而且凝血酶能够促进早期的钙化，改变了材料界面间能量的分布，可以通过二次成核作用形成钙磷沉积，这与常见的所见的晶体表面外延生长形成钙磷沉积的形式不同［6］。
   
　　骨髓基质细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，在特定的条件下可向骨、软骨、神经胶质细胞、心肌、骨骼肌、血管内皮细胞、脂肪细胞等间叶组织细胞转化，故也称为间充质干细胞。由于BMSC来源易得，取材方便，增殖能力强，可在体外大规模扩增，并且异体移植时排斥反应小，是近年来常用的组织工程种子细胞。FS与骨髓基质细胞两者之间组织相容性良好，两者的复合物可以用于修复骨缺损。Lee等人［3］模拟了FS复合BMCs在修复骨肉瘤切除后造成的骨缺损情况。他们将小鼠股骨干制成1.5 mm的缺损，分成正常组与化疗组，2组动物都采取3种不同的方法处理，结果发现：缺损部位填充FS/BMCs的动物都有明显的新骨形成，而单纯FS组及空白组中无新骨的形成，同时研究还发现：FS具有保护骨髓基质细胞免受化疗药物影响、延长细胞存活时间的作用。陈克明等人［18］利用纤维蛋白原与凝血酶生成纤维蛋白的反应过程制备了BMCs与纤维蛋白的复合物，将该复合物用于修复桡骨骨缺损，研究结果同样证实具有良好的效果。

　　3.2  FS作为细胞支架在软骨组织修复方面的应用
   
　　关节软骨缺乏自身修复能力，对于>4 mm的软骨缺损，其自发的修复过程是形成生物力学性能较差的纤维软骨或纤维瘢痕组织。以往使用的自体、异体软骨移植和人工关节移植均未能解决这一问题。组织工程学的迅速发展为关节软骨缺损的修复带来了曙光。在软骨组织工程学生物支架选择上，人工合成高分子支架因其代谢产物对于种子细胞生长有着一定的影响而在实际运用上受到一定的限制，而纤维蛋白胶由于其特殊的理化性质，成为近年来软骨组织工程支架的研究热点。Sims［19］等将牛软骨细胞种植于纤维蛋白胶支架上，然后植于裸鼠皮下，证实利用纤维蛋白胶可以构建体外组织工程化软骨。在此基础上，Silverman等［20］通过对比观察发现：软骨细胞-纤维蛋白胶复合物形成软骨的质量、数量与纤维蛋白胶内包含的软骨细胞数量直接相关，他们研究认为：每毫升FS内含4×107个软骨细胞复合物具有最佳的成软骨特性。
   
　　BMCs在特定的条件下可以分化成软骨细胞；纤维蛋白胶与BMCs复合可以用于修复软骨组织缺损。Huang等［21］将纤维蛋白胶、骨髓基质细胞与转化生长因子β１复合物包埋于皮下、肌肉及骨膜下，观察复合物诱导软骨形成的作用发现：皮下包埋组及肌肉包埋组6周后复合物周围围绕大量的细胞基质成分和血管组织，骨膜下包埋组在第2周出现软骨细胞，6周后有新生软骨的形成。黎建伟等［22］将骨髓基质干细胞(BMCs)与纤维蛋白胶(FG)的混合物用来修复陈旧性关节软骨缺损。结果发现陈旧性关节软骨缺损和新鲜缺损应用BMCs与FG复合修复的效果无明显差异，均为类透明软骨组织修复。陈旧组与新鲜组2～48周期间关节功能良好。BMCs与FG的混合物在短期内能够良好地修复陈旧性关节软骨全层缺损。

　　3.3  作为抗生素及因子的缓释载体在骨修复方面的作用
   
　　抗生素的局部药物缓释被认为是防治开放性骨折感染的一种有效方法。自从1980年Klemn首次局部应用庆大霉素-PMMA链珠防治骨与软组织感染获得成功后，对抗生素局部缓释载体的研究成为热点，但由于其存在不可吸收、含有杂质、需要二次手术取出、免疫反应、载体分解过快以及药物浓度不能维持适当时间等问题而不能广泛应用到临床中。纤维蛋白胶是模拟人体自身凝血反应最后阶段形成具有稳定三维结构的纤维蛋白多聚体，其三维网状结构也提供了较大的承载药物的表面积，其网眼间隙使药物按一定速率恒定释放，提供尽可能长的抗生素局部支持时间。Mader等人［23］利用纤维蛋白胶作为妥布霉素的缓释载体来治疗感染性的骨髓炎。结果显示：纤维蛋白胶复合妥布霉素组与妥布霉素-PMMA链珠组治疗效果相似，与PMMA相比，FS的应用更加安全、方便。但是由于他们的试验动物样本较少，所得的结果有待进一步的考证。Gao等人［24］将纤维蛋白胶作为骨形成蛋白及庆大霉素的共同载体，Ⅰ期治疗感染性的骨缺损。研究发现：FG-BMP-庆大霉素复合组在控制感染及骨修复方面均有良好的效果。陈仲等人［25］对32例开放性骨折患者伤口局部应用蛋白胶-庆大霉素复合体防治骨折感染，其中2例发生伤口局部感染，感染发生率6.12%，治愈后随访3个月均无感染复发；而空白对照组发生伤口局部感染9例，感染发生率为23.1%，治愈后随访3个月有5例患者发生伤口局部感染复发，其中2例诊断为骨髓炎。
   
　　利用FS形成前，其组成成分可溶解于流体物质的特性，复合多种能够促进骨修复和创伤愈合的生物因子，使其在发挥原有的止血、黏合、修复作用的同时，还具有强大的成骨能力，在骨修复过程中有较高的临床实用价值。Han等［4］用纤维蛋白封闭系统(FFSS)和rhBMP4复合物治疗8 mm的颅骨缺损，植入后2周、8周分别取材进行组织学研究，结果发现FFSS与BMP复合组在新骨形成的能力及质量上均好于单纯FFSS组与空白对照组。分析原因，他们认为是由于FS刺激了未分化的间充质细胞增殖，促进毛细血管增生和长入，为BMP的诱导活动提供了丰富的靶细胞环境和理想的微环境。同时，FS天然的网状微观结构有助于BMP等生长因子的附着及与靶细胞的接触，其强大的黏着力有利于BMP等生长因子的缓慢释放，随着FS的降解，在植入材料的周围形成了一个BMP浓度梯度，增加了BMP等生长因子与靶细胞作用的时间，使其骨诱导活性得以最大限度地发挥。充分发挥其诱导功能，骨生长因子的释放几乎伴随新骨形成的全过程，因而为新骨的形成提供了非常有利的内环境。Zhu等［26］研究了纤维蛋白胶体复合BMP修复软骨缺损的能力，结果表明该复合物具有良好成软骨的特性，可以用于修复关节软骨。这是由于纤维蛋白胶作为生物性材料，其内部良好的微环境及大分子蛋白可保护BMP不发生非特异性蛋白水解，防止生长因子局部流失，尽可能长时间的保护特定条件BMP诱导成软骨的活性。
   
　　理想的细胞支架应该具有良好的组织相容性、降解速度、一定的机械强度、可塑性；利用细胞生长贴附的细胞-材料界面，具有无毒、无免疫反应等特点。纤维蛋白胶作为细胞支架材料还存在降解时间较快、机械性能较差等缺陷。如何改善纤维蛋白胶的降解时间，增强其力学性能将是今后研究的方向。
   

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作者单位：中国人民解放军总医院骨科，北京市复兴路28号 100853