消旋聚乳酸混合壳聚糖短状骨髓内钉固定骨折的动物实验研究

【摘要】  ［目的］探讨消旋聚乳酸（PDLLA）混合壳聚糖（CHS）短状骨髓内钉加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对骨折愈合的影响，以期为临床应用提供参考。［方法］以新西兰大白兔胫骨中段截骨为实验模型，成年新西兰大白兔120只，分成6组，实验组（A组）：为（PDLLA+CHS+ bFGF）；对照组：5组，每组18只：B组用PDLLA混合壳聚糖髓内钉；C组用单纯PDLLA髓内钉固定（PDLLA）；D组用单纯PDLLA加bFGF；E组用单纯克氏针；F组用克氏针加bFGF。术后于4、8、12周处死动物，实验组每次10只，对照组每次各6只，进行放射学、大体观察和组织学检查比较。［结果］第20 d有2只兔术侧跟部皮肤溃破，外科换药后痊愈，其他健康存活到观察时间。在大体标本骨折愈合方面：A组与F组相比无显著性差异（P<0.05），提示可吸收材料在骨折最终愈合与克氏针固定时无差异。A组与其他对照组相比有显著性差异（P<0.05），提示A组骨折愈合效果较好。在X线评分及组织学骨折愈合观察： A组骨折愈合效果优于其他对照组。加用CHS对骨折愈合有利，加用bFGF对骨折愈合有促进作用。［结论］PDLLA混合壳聚糖髓内钉具有良好的生物相容性，排异反应小，有利于骨与关节功能恢复。而且加用bFGF对骨折愈合有促进作用。在临床低应力部位骨折尤其在手外科指骨骨折内固定中，本方法有很大应用前景。

【关键词】  可吸收材料； 髓内钉； 骨折

Animal experimental study of fracture fixation with PDLLA mixed with chitosan∥HUANG Chaotong，LI Jingkuang,ZHU Jiakai,et al.Microsurgery Center，Affiliated Houjie Hospital of Guangdong Medical College，Dongguan,Guangdong 523945,China

    Abstract：［Objective］To explore the effect of fracture healing with intramedullary nail of polyDLlactic acid (PDLLA) mixed with chitosan and basic fibroblast growth factor (bFGF),and provides the basis for clinical application.［Method］Middle tibia fracture model of 120 healthy adult rabbits of New Zealand were established and randomly divided into 6 groups as follows:experimental(A):30 rabbits with PDLLA+CHS+ bFGF;control:5 groups(18 animals for each group):control(B) with PDLLA+CHS,control(C) with PDLLA,control(D) with PDLLA+bFGF,control(E) with Kirschner’s wire,and control(F) with Kirschner’s wire+bFGF.Radiological and histological followup was performed in 4,8,12 weeks postoperatively.［Result］All animals were survival.There was no significant difference (P<0.05) of the fracture healing between group A and F.It was illustrated that there was no difference of the final fracture healing between absorbable material and Kirschner’s wire.There was significant difference (P<0.05) in radiological and histological findings of the effect of fracture healing between A  and other control groups,that was illustrated the effect of group A was better than others.They were also illustrated that CHS and bFGF had the function of promotion of fracture healing.［Conclusion］Intramedullary nail of PDLLA mixed with chitosan has satisfactory biocompatibility,minor rejection and promote functional recovery of bone and joint.Also bFGF has the function of promotion of fracture healing.It has dynamogenetic value of the fracture fixation in low stress location especial fracture of phalanx of finger.

    Key words：absorbable material；  intramedullary nails；  fracture

    坚强内固定器械导致的应力遮挡是造成再骨折的主要原因。因此，理想的固定器械应该能在骨折愈合后通过降解逐渐将机械应力转移到骨上，加快骨结构的重塑构建，并且材料能被组织完全吸收。许多研究者都在寻求合适的可吸收材料。国内的研究主要集中在PDLLA及其增强合成物方面，取得很大的进步［1］。本实验通过模拟非负重骨髓内固定时的条件，评估PDLLA混合壳聚糖髓内钉加bFGF对骨折愈合的影响，为PDLLA混合壳聚糖髓内钉在手外科创伤中，特别是在掌骨及指骨骨折髓内固定的临床应用提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1   实验材料

    由本课题组自行研制，在PDLLA棒中混合加入适当比例的壳聚糖制成可吸收髓内钉材料，规格设计为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mm，长度为6～8 cm，形状类似牙签，委托中山大学高分子研究所生产。本实验材料选取用直径为2.5 mm型号的髓内钉。PDLLA棒由四川省成都迪康中科生特医学材料公司提供，bFGF由广东省珠海东大生物制药公司提供。

    1.2  实验动物及方法

    新西兰大白兔120只，体重2.15～3.10 kg，雌雄不限，由中山大学医学院动物实验中心提供。将动物随机分成6组，实验组30只，对照组每组各18只。5%异戊巴比妥钠(0.18～1 ml/kg)静脉麻醉，于术侧小腿区域备皮，0.15%碘伏消毒，铺无菌巾单。在小腿胫前表面作纵形切口，切开皮肤及肌层达胫骨骨面，用剥离子剥离骨膜显露胫骨中段，用摆锯于胫骨中段垂直截断。于断面用直径为2.5 mm克氏针先行扩大近、远断端髓腔，用该克氏针沿髓腔先固定胫骨近断，自胫骨平台穿出，留小部分针段在髓腔内，暂不完全拔出，裁取合适长度的可吸收髓内钉，插入胫骨近断髓腔，再将余出的髓内钉插进胫骨远端，对合骨折端，达到骨折复位，再用骨锤敲打克氏针，以使近断髓腔的髓内钉充分固定胫骨远端，满意后，拔出克氏针。为防止旋转及分离，可预先在距断端5 mm部位，各钻1孔,孔径约1 mm，并对应穿过1/0肌腱线备用，骨折复位后即予打结，达到牢靠固定。再逐层缝合，闭合伤口。

    1.2.1  实验组（A组）  用PDLLA混合壳聚糖髓内钉固定，并于骨折处加bFGF（0.1 ug/ml）1ml，为（PDLLA+CHS+ bFGF）。

    1.2.2  对照组  B组：用PDLLA混合壳聚糖髓内钉固定，不加bFGF（PDLLA+CHS）。C组：用单纯PDLLA髓内钉固定（PDLLA）。D组：单纯PDLLA髓内钉固定，骨折处加bFGF 1 ml，为（PDLLA+ bFGF）。E组：克氏针直接髓内固定，不使用髓内钉。F组：克氏针髓内固定+ bFGF（表1）。

    　　术毕切口碘伏消毒，纱布包扎，薄棉片衬底用树脂绷带管形固定术侧（膝关节伸直、踝关节屈曲90～100°位），固定范围超过膝关节2 cm，踝关节4 cm。术后3 d每日分别肌注青霉素40万U。术后8周去除外固定，每组术后于4、8、12周注射过量水合氯醛处死动物，实验组每次10只，对照组每次各6只，进行放射学、大体观察和组织学检查。

    1.3  观察指标

    1.3.1  临床情况观察  术后观察动物的进食、饮水、活动情况、检测伤口愈合情况及局部组织反应。

    1.3.2  骨折部位正、侧位X线片，观察实验动物骨折对线对位及愈合情况。采用赵志怀等［2］的X线片骨痂定量打分标准。

    1.3.3  沿原手术切口切开皮肤及肌层，剥离骨膜组织，大体观察骨折端愈合情况，取下胫骨，从髓腔内取出材料用生理盐水洗净，进行形态观察，包括材料形状、色泽及表面变化情况。

    1.3.4  取胫骨中段上下各1 cm范围的骨块，沿长轴方向纵切取材，常规石蜡包埋制片，HE染色，进行组织学检查，比较骨质愈合有无差异。完全横断性骨折其骨折愈合的速度是以骨折两断端间区内各种骨折愈合成份中骨性骨痂所占相对面积的百分率为指标。参照夏志道等［3］的定理学研究方法，将求出的各组数据进行统计学处理分析。

    1.4  统计学评价

    采用SPSS统计软件（10.0版本），相关数据以均数±标准差表示，多组间比较采用KruskalWallis法统计，两组间比较选用Nemenyi法检验，P<0.05为有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  临床情况观察

    4只兔子术后进食、饮水差，其余2～4 h进食、饮水尚正常。共有6只兔子死亡，2只在1周内死亡，可能原因：（1）麻醉药品用量过大；（2）手术创伤大，致术后进食差；（3）外固定限制活动；4只在第3周内死于肺部感染，死亡兔均另兔行手术进行补充，以保证实验兔足够情况。第20 d有2只兔术侧跟部皮肤溃破，外科换药后，痊愈。其他兔子健康存活到观察时间。术后8周去除外固定。

    2.2  大体标本骨折愈合情况比较

    对各时间段各组标本，进行大体观察骨折端愈合情况（表达式）。A、F组相比无显著性差异（P>0.05），提示可吸收材料在骨折最终愈合与克氏针固定时无差异。A组与其他对照组相比有显著性差异（P<0.05），提示A组骨折愈合效果较好。

    2.3  髓内钉形态观察

    术后4周时，A组和对照组B组所置的可吸收PDLLA混合壳聚糖髓内钉材料表面不平，对照组C、D组髓内钉材料透明度降低，材料表面不平；8周时，A、B组髓内钉材料表面无光泽，略粗糙，无变形，对照组C、D组髓内钉材料透明度进一步降低，材料表面略粗糙；12周时，A、B组髓内钉材料表面无光泽，粗糙，仍无变形，对照组C、D组髓内钉材料不透明，材料表面粗糙，无光泽。

    2.4  骨折愈合X线评分情况比较（图1a～f）

    术后4周时，A组X线及组织学检查见骨断端间有新骨形成，已完全愈合，X线评分结果（表2）。A、F组相比无显著性差异（P>0.05），但A组与其他对照组在各相同时期相比有显著性差异（P<0.05），提示A组骨折愈合效果优于其他对照组。B组与C组相比有显著性差异（P<0.05），提示加用CHS对骨折愈合有利，A组与B组，D组与C组，F组与E组相比有显著性差异（P<0.05），提示加用bFGF对骨折愈合有促进作用。

    2.5  组织学骨折愈合观察（图2a～f）

    术后4周时，A组镜下未见急、慢性炎性细胞浸润。8周时，A组组织学检查见骨断端已由新骨连结。12周时，A组镜下骨折已完全愈合，为成熟的板状骨，形态学上无差异。具体如表3。A、F组相比无显著性差异（P>0.05），但A组与其他对照组在各相同时期相比有显著性差异（P<0.05），提示A组骨折愈合效果优于其他对照组。B、C组相比有显著性差异（P<0.05），提示加用bFGF对骨折愈合有促进作用。

    图1a  PDLLA+CHS+bFGF组术后12周情况  图1b  PDLLA+CHS组术后12周情况  图1c  PDLLA组术后12周情况  图1d  PDLLA+bFGF组术后12周情况  图1e  克氏针组术后12周情况  图1f  克氏针+ bFGF组术后12周情况  图2a  软骨区与软骨膜的发生  图2b  骨小粱的形成  图2c  生发层成骨细胞大量存在（无荧光）  图2d  生发层成骨细胞大量存在（荧光）  图2e  哈费斯系统建立  图2f  哈费斯系统建立的形态发生

    3  讨  论

    可吸收材料用作骨科骨折的内固定在国外已有近20年的历史［4］。国内近年来已有采用可吸收材料用于骨折内固定的报道，其应用前景日渐引起关注［5,6］。理想的可吸收内固定材料须具备以下条件：(1)良好的生物相容性;(2)足够的机械强度以保证骨折的愈合;(3)最终能彻底降解且其残体和代谢产物可以完全排出体外。

    作者的研究结果表明可吸收PDLLA混合壳聚糖髓内钉置入家兔体内后切口均Ⅰ期愈合，无外露或排出，组织学检查置入后各个时期无囊性积液和急、慢性炎性细胞侵润，证明该材料具有良好的生物相容性。

    本组实验结果显示，在应用可吸收PDLLA混合壳聚糖髓内钉加bFGF治疗后，X线检查表现为骨痂出现早，骨折愈合早；大体标本观察骨折愈合例数多；骨组织学观察其骨性骨痂相对面积百分率高（表3）。在单纯PDLLA加用CHS对骨折愈合有利，再合用bFGF对骨折愈合有促进作用。综合说明，在应用可吸收PDLLA混合壳聚糖髓内钉固定的基础上，加bFGF能加速成消肿和骨痂形成，能促进骨折早期愈合。表1  实验组与对照组分组情况组  别动物数表2  动物骨折后X线片评分值（分）比较表3  骨性骨痂相对面积百分率

    由于作者将胫骨中段垂直截断，受小腿肌肉运动的牵拉，髓内钉固定后要承受一定的应力，术后兔术侧下肢给予外固定，使骨折端处于轻微负重状态，模拟临床掌、指骨骨折处理后的状况，得出的结果对临床实践可有一定的借鉴，通过大体及放射学观察，实验组骨折对位尚属满意。在非应力或应力较小的部位，可吸收髓内钉可提供与克氏针相同的稳定性，可吸收内固定材料在手外科应用有以下优点：（1）不需要二次手术取出，减少组织创伤瘢痕对手功能的影响；（2）对掌、指骨骨折内固定有其优势，不影响掌指关节、指间关节的早期功能锻炼；（3）在手指和掌骨这些肌肉力量不大的部位骨折固定，文献表明是可吸收内固定材料的主要适应证；（4）掌、指骨的血供较丰富，有利于及时清除可吸收内固定材料的降解产物，减少或避免组织副作用。

    　　综上所述，作者认为可吸收PDLLA混合壳聚糖髓内钉具有良好的组织相容性，降解过程中对骨质愈合无干扰，在非承重或承重较小的部位，可提供与金属克氏针相同的稳定性，而且加用bFGF对骨折愈合起促进作用。考虑到其自身强度，可用于非负重部位的固定，在临床低应力部位骨折尤其在手外科掌、指骨骨折内固定中，应有很大应用前景。

【参考文献】
  ［1］ 丁永利，宋跃明，段 宏，等.用国产聚D，L乳酸棒行骨折内固定的动物实验［J］.中国矫形外科杂志，2003,11:539.

［2］ 赵志怀.X线片骨痂定量探讨与应用［J］.中国中医骨伤，1995，3:8.

［3］ 夏志道.家兔骨折愈合中骨痂组织学定量学研究［J］.中国中医骨伤,1994，2:8.

［4］ Bostman O,Vainionpaa S,Hairvensalo E,et al.Biodegradable internal fixation for malleolar fractures［J］.J Bone Joint Surg（Br）,1987,69:615-618.

［5］ 刘欣闻，董 扬，施忠民，等.可吸收棒在外翻截骨矫形中的应用［J］.中国矫形外科杂志,2006,14:514-515.

［6］ 王亚生，林乔龄，陈定家，等.可吸收螺钉临床应用87例体会［J］.中国矫形外科杂志，2005，13：1563-1564.

作者单位：广东医学院附属厚街医院显微外科中心，东莞