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【摘要】 ［目的］探讨异种脱蛋白松质骨（deproteinization bone,DPB）作为骨组织工程支架性能及其成骨作用。［方法］采用脱蛋白法制备异种松质骨支架，复合一定数量的自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)构建个体化组织工程骨。24只6～8个月龄雄性青山羊为受体制作脊柱L3、4横突间植骨模型。实验根据不同植入物分为3组：异种DPB复合一定数量的自体MSCs构建组织工程骨；单纯DPB；自体髂骨。各时间段通过手检、影像学、组织学以及机械性能测试并对比分析来评价其成骨性能。［结果］异种DPB保持了天然网架结构，与山羊MSCs具有良好的生物相容性。各组材料脊柱横突间融合情况：组织工程骨植入横突间组织学表现为多点成骨，融合效果良好，不同时间段影像学与自体髂骨组基本一致。单纯DPB植入组随时间推移大部材料吸收，仅桥接骨床部有少量骨痂生成。12周后各组融合强度组织工程骨组优于单纯DPB组而接近自体髂骨组。［结论］以异种DPB为支架复合一定数量自体MSCs构建组织工程骨,其成骨能力接近于自体骨。单纯DPB成骨能力差，不能作为骨移植材料。
【关键词】 组织工程骨； 异种脱蛋白松质骨； 横突间融合
Spinal fusion of lumbar intertransverse process in a goat by using tissue engineered bone with xenogeneic deproteinized bone as scaffold∥GAO Chun-yang,SUN Ge,HAN Dong-mei,et al.Department of Orthopedics, the Affiliated Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011,China
Abstract: ［Objective］To study the properties of xenogeneic deproteinized bone （DPB） used as scaffold in the bone tissue engineering and its application to the spinal fusion of the lumbar intertransverse process in a goat. ［Methods］The deproteinized bone was derived from an adult pig femoral cancellous bone through physical and chemical treatments.The cell-material complex was observed under the inverted phase contrast microscope to evaluate the adhesion and the growth of the osteoblasts. The experimental model of the spinal fusion in the lumbar intertransverse process was produced in 24 male goats aged 6-8 months, which were divided into 3 groups according to different implant graft. All the samples were harvested at 4,8,12 weeks postoperatively, and a series of examinations were performed, including the radiography and the histomorphological assay.［Results］It showed that The DPB maintained natural pore network system, it hardly had any antigen, so it had good histocompatibility. In the spinal fusion model of lumbar intertransverse process,the cell-material complex could form cartilage and had a new bone formation in a multipoint way, the osteogenic process was almost the same as the auto-ilium osteogenesis and had a good mechanical strength.［Conclusion］The xenogeneic deproteinized bone is a good material in the bone tissue engineering, which can be used as an osteogenesis scaffold and provides a stable fusion.
Key words：tissue engineered bone; deproteinized bone； spinal fusion
骨移植是骨科常用治疗方法。自体和同种异体骨植骨虽能获得较好临床效果，但存在各自的缺点［1］。新一代骨移植材料都是模仿自体骨一个或多个因素，组织工程骨提供了一种全新方法。目前以去抗原同种异体骨为载体复合种子细胞构建组织工程骨取得了令人鼓舞的成绩，已初步试用于临床并取得较好效果。问题：异体骨获得程序复杂；社会伦理学制约；供体不足。因而异种骨支架材料的研究成为有意义的工作。动物骨均有相似的生物材料结构和造型，关键问题是植入体内免疫问题［2］。以往许多研究证明采用脱蛋白方法可达到消除异种骨免疫原性目的，这暗示着异种骨可能会是一种经济、有效的组织工程骨支架材料。本试验采用脱蛋白法制备异种松质骨支架，复合一定数量的自体MSCs构建个体化组织工程骨，以6～8个月龄青山羊为受体动物模型进行脊柱横突间融合，各时间段通过手检、影像学、组织学以及机械性能测试来评价其成骨性能。
1 材料与方法
1.1 DPB支架制备 取成年猪新鲜股骨远端松质部分，所截取骨块内不含软骨及皮质骨成分，初制为3 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，其长轴与所取松质骨骨小梁排列方向一致，取材各骨块的表观孔隙密度基本相同。参照Marts方法，骨块1∶1氯仿甲醇液脱脂24 h，50℃蒸馏水震荡冲洗，20%H2O2浸渍24 h。反复3次。每阶段利用倒置显微镜观察骨块大体形态结构直至骨孔内无细胞、基质等组织成分。将处理后的骨块蒸馏水于室温下浸泡透析24 h，烘干。全自动氨基酸分析仪（日立I-8 800）测定分析羟脯氨酸、酪氨酸、色氨酸的含量。每块电子天平称重（1±0.1） g。
1.2 组织工程骨构建 受体山羊术前三周髂骨穿刺取骨髓，梯度密度离心法分离获得骨髓间充质干细胞，经原代和传代培养扩增，调整细胞密度为1×106/ml，接种于DPB载体至饱和，置入无菌抽滤瓶，抽干空气，负压使其分布均匀，成骨诱导细胞培养液成骨诱导分化7 d备用。成骨诱导细胞培养液为DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+10－7mol/L地塞米松＋10 mmol/L β-甘油磷酸钠＋50 mg/L维生素C＋青、链霉素100 μ/ml，pH 7.3。
1.3 动物模型制备和试验分组（见表1）
24只青山羊随机分Ⅰ、Ⅱ两组，每组12只。术前1 d禁食。氯胺酮10～15 mg/kg肌注麻醉。俯卧位，腰骶部正中切口，纵形切开皮肤、筋膜，向两侧钝性剥离椎旁肌，暴露L2～5椎板并采用Luque棒内固定，暴露双侧L3、4横突。去除横突间内侧皮质骨暴露松质部分，制成横突间植骨床(间距3 cm)，材料植入。自体骨组采用相同大小和形状的髂骨。表1 植入物分组情况组别左侧右侧Ⅰ组A组 组织工程骨C组 自体骨Ⅱ组B组 脱蛋白松质骨C组 自体骨
1.4 观察指标及方法
1.4.1 X线评分 分别于术后4、8、12周用岛津X线机连续脊柱融合段摄X线片。所有X线片均由对组别和时间点双盲的人员根据Lane等的X线评分标准对各组移植区骨形成及融合情况进行放射学评分。
1.4.2 组织学检查 截取包括临近横突部的融合材料，10%甲醛固定72 h，8%EDTA脱钙，酒精逐级脱水，二甲苯透明石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察术后4、8、12周移植区的骨形成情况,并根据Nilsson OS骨愈合评分标准进行组织学评分。
1.4.3 第12周各组标本进行3点弯曲力学测定。L3、4融合段脊柱沿矢状面截断，咬除关节突，切断椎间盘，仅保留融合块和横突间相连。两端椎体分别置于自制方盒内，用高强度牙托粉固定，保持两端同轴、同水平，置于微机控制电子万能力学测试仪上，装置采用500 kN的传感器、1 mm/min匀速弯曲加载，测量最大完全载荷。
1.5 统计学方法 应用SPSS 10.0软件包对检查结果进行数据统计学处理，采用ANOVA方差分析并行方差齐性检验；所得数据用均数±标准差(x-±s)表示,并计算P值，P<0.05为差异显著（图1～7）。
2 结果
2.1 构建的组织工程骨形貌特征
脱蛋白处理后的猪松质骨为大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构，无细胞、神经、血管和嗜酸性物质染色。羟脯氨酸的含量与新鲜松质骨相比无明显差异，酪氨酸、色氨酸波峰消失。接种后的MSCs第7 d细胞基质分泌旺盛，几乎充满支架孔隙。
2.2 一般情况
术后3～4 h动物清醒并开始活动，活动量少，精神状态较差，少量饮食。1 d后恢复正常，无肢体活动受限及跛行。1例术后3 d切口感染，有脓性分泌物，考虑为术中污染所致，经拆线引流、抗生素治疗后愈合。其他动物生长良好。
2.3 不同时间点影像学观察及评分(见表2)
各组植入材料位置良好，早期A、B两组融合情况大体一致。C组第8周上下桥接部间隙变小，连续骨痂生成。12周后A组评分略低于C组，但无统计学意义（P>0.05），B组与C组差异显著（P<0.01）。表2 各组术后不同时间的X线评分
2.4 不同时间点组织学观察及评分(见表3)表3 各组术后不同时间的组织学评分
2.5 第12周脊柱横突间不同移植材料成骨融合生物力学测定结果(见表4)
脊柱横突间不同移植材料成骨融合后的3点弯曲最大载荷见表4。A组略低于C组，统计学差异不显著(P>0.05)，而B组与C组差异显著(P<0.05)。表4 第12周脊柱横突间不同移植材料成骨融合
3 讨论
组织工程需要合适的载体，异种松质骨具有与自体骨相同的骨小梁结构，不存在供体来源有限及医学伦理问题等缺点。但由于异种骨种属间的抗原差异,组织相容性差，直接用于骨的修复会引起强烈的免疫排斥反应而受到限制［3］，因此去除抗原物质是保证异种松质骨载体良好性能的前提。目前常用的脱钙方法较大程度地破坏了骨的微结构,影响其骨传导作用，同时降解速度快，与成骨速度不匹配［4］。根据异种骨中的抗原性物质主要存在于骨陷窝内的细胞及黏性蛋白、多肽及脂肪组织而胶原和无机盐几乎无抗原性的特点，采用温和的脱蛋白方法去除异种骨中的抗原性成分而不破坏胶原，以期得到更加符合骨修复要求的载体材料。 图1Luque棒固定L2～5节段 图2横突间植入材料 图3术后12周标本X线片情况。从左至右A组、C组 图4术后12周标本X线片情况。从左至右B组、C组 图5A组术后12周编织骨交错排列大量骨髓形成，新生骨完全桥接横突骨 HE×100 图6B组术后12周近横突部少量新生骨向材料内生长，载体材料大部吸收，由纤维组织充满充填 HE×100 图7C组术后12周新生骨逐渐改建为板层骨，与横突自然连成一体，新生骨小梁成熟，取代自体骨 HE×100 Frank认为芳香族氨基酸与免疫反应密切相关。胡永康等也曾对骨基质进行氨基酸分析，证实了含有芳香族氨基酸浓度越高，组织学反应越重。检测骨基质中羟脯氨酸、脯氨酸及芳香族氨基酸含量，可特异地反映有机质中包括胶原蛋白在内的各种组成成分的变化［5］。因而在材料制备中氨基酸定量化分析指导松质骨脱蛋白调控，可能降低去免疫原的不确切性，并寻找到一个合适的脱蛋白时间点，即去除免疫原同时最大程度保持脱蛋白松质骨力学性能。实验结果显示处理液中羟脯氨酸含量低微，在骨中含有羟脯氨酸的蛋白质只有胶原，表明脱脂和脱蛋白处理对猪骨胶原破坏轻微，对保持异种骨基质的天然状态无较大影响。新鲜骨氨基酸图谱中色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸含量较高，而处理骨其波峰消失，证明去抗原成分的有效性。观察DPB可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构，孔隙率60%以上，孔隙大小200～500 μm。MSCs接种于DPB载体早期呈梭形或多角形贴附，细胞密度大。7 d后细胞与材料紧密黏附，相邻细胞间有突起互相连接，周围有网状胶原附着。
横突间周围肌肉组织丰富，植骨床条件好，横突相当于桥墩的作用，对植骨块的稳定起重要作用［6］。术后影像学显示材料位置良好，组织工程骨组各时间段融合情况与自体骨大体一致。早期组织工程骨密度略低于自体骨，组织学观察提示为支架材料早期吸收速度快于自体骨，随着自身成骨的进行，12周后基本相同。组织工程骨不仅与横突植骨床桥接部有新骨形成，移植材料周围和内部也有新骨形成，多点岛状生长的新生骨组织贯穿整个移植材料。DPB由于自身缺乏骨诱导活性，单纯植入成骨较差，作为自体种子细胞支架具有良好性能。在组织工程骨成骨中，脱蛋白骨的作用就象一个骨传导支架，为再血管化和成骨细胞的分化提供一个稳定的环境［7］。
采用组织学和影像学评价各种移植材料在脊柱横突间成骨效果具有比较客观意义，反映其力学性能上的变化［8］。通过检测脊柱融合强度可以反映成骨质量，而且对骨材料最终用于骨修复具有指导意义。作者将12周各组标本进行三点弯曲力学测定，检测前将L3、4融合段脊柱沿矢状面截断，咬除关节突，切断椎间盘，仅保留融合块和横突间相连，排除其他干扰因素，最大程度反映融合段力学强度。实验结果证明组织工程骨组强度高于单纯脱蛋白松质骨组而与自体骨接近。异种脱蛋白松质骨为支架，复合一定数量自体MSCs构建组织工程骨,其成骨能力达到与自体骨移植相似效果,单纯异种脱蛋白骨缺乏骨诱导能力，仅依靠骨传导，其成骨能力差，不能作为骨移植材料，但作为组织工程骨支架具有良好前景。
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作者单位：牡丹江医学院红旗医院骨科，牡丹江爱民区通乡路5号 157011