P 21WAF1 蛋白和层粘连蛋白（LN）在结节性甲状腺肿中的表达

    【摘要】 目的 研究P 21WAF1  蛋白和层粘连蛋白（LN）在结节性甲状腺肿中的表达水平及意义。方法 应用免疫组化SP法检测50例结节性甲状腺肿、40例正常甲状腺组织、40例甲状腺癌标本中P 21WAF1  蛋白和LN的表达。结果 P 21WAF1  蛋白和LN表达阳性率在结节性甲状腺肿分别为52.14%±29.02%，26.45±15.89;正常甲状腺组织为87.01%±7.21%，20.45±10.2;甲状腺癌为14.20%±12.04%，60.12±23.77;三者比较差异有显著意义（P<0.01）。甲状腺癌P 21WAF1  LI和LN的表达呈负相关（r=-0.610，P<0.05）。结论 P 21WAF1  LI和LN联合测定对鉴别良恶性甲状腺肿瘤有一定的临床价值。 

　　Zhao Wenli，Yang Qingxu，Wu Tongtong.
   
　　Department of Pathology，Huizhou Municipal Central Hospital，Huizhou516001.
     
　　【Abstract】 Objective To explorer expression of P 21WAF1  protein and Laminin（LN）in nodular goite and its significance.Methods Immunohistoche mistry method-SP was used to detect expression of P 21WAF1  protein and LN in nodular goiter（50cases），normal thyroid tissues（40cases）and thyroid cancer（40cases）.Results The positive expressive rate of P 21WAF1  protein and LN was52.14%±29.02%，26.45±15.89in nodular goiter，87.01%±7.21%，20.45±10.2in normal thyroid tissues and14.20%±12.04%，60.12±23.77in thyroid cancer.P 21WAF1  protein and LN expression in different thyroid tissues was significantly different（P<0.01）.P 21WAF1  protein and LN expression positively related to the thyroid canceration.Conclusion The expression of alliance could got the beter value than the single expression for the patients with nodular goite.
   
　　Key words nodular goiter thyroid cancer P 21WAF1  protein laminin  

　　结节性甲状腺肿是一种常见的甲状腺疾病，发病率可高达6%～7% ［1～2］  ，对于结节性甲状腺肿是否属于癌前病变，尚属一个有争议的问题。我们通过研究P 21WAF1  蛋白在结节性甲状腺肿中的表达，并分析其在此类疾病中发生发展中的作用和意义，为临床正确认识结节性甲状腺肿提供理论依据。
   
　　1 资料与方法
   
　　1.1 临床资料 收集本院1994～2002年甲状腺手术切除标本，其中结节性甲状腺肿50例，结节周围正常甲状腺组织40例，甲状腺癌40例，所有标本经10%的甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚度4μm。
   
　　1.2 检查方法 （1）P 21WAF1  BD表达:采用SP免疫组化法，所用试剂P 21WAF1  鼠抗人单克隆抗体（4D-10）及SP试剂盒均为Santa Cruz公司产品，购自北京中山生物技术公司。（2）LN表达:抗LN单克隆抗体为Sigma公司产品，购自博士德公司。SP试剂盒为美国Matrix公司产品，即用型，福建迈新生物技术开发公司提供。采用SP免疫组化法，每组试验均用已知阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 结果判断 （1）P 21WAF1  蛋白阳性着色定位于细胞核，随机选择5个高倍视野，计数1000个细胞中阳性着色细胞百分率作为P 21WAF1  表达指数（P 21WAF1  labeling index，P 21WAF1  LI），规定P 21WAF1  LI<52.14%为P 21WAF1  低表达组，P 21WAF1  LI≥52.14%为P 21WAF1  高表达组。（2）LN免疫组化染色以围绕腺体或癌巢基底膜呈棕黄色线性染色的完整性分为3级: 围绕完整为强阳性，不完整或变薄、缺损为阳性，棕黄色而不形成基底膜为弱阳性或阴性。
   
　　1.4 统计学处理 正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺癌组织中P 21WAF1  LI及LN表达采用X 2 检验。

　　2 结果
   
　　2.1 结节性甲状腺肿、正常甲状腺及甲状腺癌中P 21WAF1  蛋白的表达 结节性甲状腺肿伴发癌变为14%（6/42），其中P 21WAF1  高表达患者22例，无1例发生癌变;P 21WAF1  低表达患者20例，6例发生癌变。P 21WAF1  蛋白表达阳性率低（P 21WAF1  LI<52%）的结节性甲状腺肿其癌变率明显高于高表达组（P 21WAF1  LI≥52%），两者比较差异有显著性（X 2 =5.445，P<0.05）。
   
　　2.2 LN在甲状腺组织中的表达 LN在正常甲状腺组织中的滤泡上皮细胞、间质细胞未见免疫反应物，有2例基底膜呈极浅的淡黄色，不形成基底膜，为弱阳性。在所有12例阳性甲状腺瘤中，腺瘤细胞的基底膜均呈均匀的棕色线条样结构，围绕完整，为强阳性表达，细胞外间质无免疫反应物出现，绝大多数甲状腺瘤细胞胞浆内无棕色免疫反应物，但在滤泡性腺瘤内生长活跃的乳头状瘤细胞，胞浆内有大量棕色免疫反应物，呈强阳性表达。LN在甲状腺滤泡性腺癌与乳头状腺癌细胞浆和基底膜均有深棕色强阳性免疫反应物存在，基底膜宽窄不一，呈连续或不连续的深棕色线样结构，血管内皮细胞下基底膜亦呈深棕色线状。

　　2.3 各组P 21WAF1  和LN的表达比较 见表1。

　　表1 各组P 21WAF1  和LN的表达 （X±s）（略）
    
　　注:与正常甲状腺组织比较 b P<0.05， c P<0.01;与结节性甲状腺肿比较 d P<0.05
    
　　2.4 甲状腺癌P 21WAF1  LI和LN的表达呈负相关（r=-0.610，P<0.05）。
   
　　3 讨论

　　P 21WAF1  基因定位于人染色体6p21.2，编码含有164个氨基酸、分子量为21KD的蛋白质，目前认为P 21  的功能主要有以下几方面:（1）由于P 21  N端氨基酸及49-72氨基酸分别能与cyclin，CDK结合，从而使cyclin-CDK复合物的激酶活性丧失，使细胞周期停滞于G 1 期 ［3］  ，P 21  是目前认为最广泛的激酶抑制蛋白。（2）P 21  C端第124-126个氨基酸与PCˉNA结合，覆盖PCNA上的某些功能区，阻碍PCNA与DNA聚合酶δ形成复合物，使DNA全酶复合物不能在DNA单链上滑动，影响DNA复制 ［4］  。（3）细胞应激时，P 21  的N末端与应激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）结合，SAPK活性受阻，使c-jun不能磷酸化，AP-1不能激活，导致信号转道通路受阻，也可引起细胞生长分化功能抑制 ［5］  。（4）低浓度P 21  可刺激相关功能基因磷酸化，促进G 1 向S期转化，高浓度P 21  则抑制四聚体的激酶反应，使细胞周期停滞，故推测P 21  可正性调节CDK的聚集。（5）P 21  可促进未分化细胞的分化，促进正常分化细胞的衰老和死亡。P 21WAF1  蛋白是负调节细胞周期因子，通过封闭CDK激酶活性中心而终止细胞周期，最终达到抑制肿瘤的作用 ［3］  。由于P 21WAF1  是一种至今罕见突变的肿瘤抑制基因，可认为免疫组化检出的P 21WAF1  均有生物学功能。本实验结果显示，从正常甲状腺组织、结节性甲状腺肿及甲状腺癌中，P 21WAF1  蛋白的表达水平呈逐渐递增的趋势，差异具有显著性。并且P 21WAF1  蛋白高表达组其癌变率增加。此研究结果从一个 侧面表明，结节性甲状腺肿中抑癌基因的水平的降低，使其丧失了抑制细胞增殖，促进细胞分化功能，可能成为其癌变的基础。
   
　　LN是重要的细胞外基质成分之一，又称基底膜连接蛋白，属结构性糖蛋白或非胶原结缔组织蛋白，由3条肽链组成，是基底膜的主要组成部分 ［6］  。本实验显示，LN仅在少数正常甲状腺组织中基底膜为极浅的淡黄色，呈弱阳性或阴性;在腺瘤组织中腺瘤细胞的基底膜呈均匀的深棕色线条样结构，均为强阳性表达;在甲状腺滤泡性腺癌组织中，LN阳性表达率达较甲状腺瘤组织中阳性表达率增高，差异具统计学意义（P<0.05）。且深棕色的强阳性免疫反应物不仅出现于基底膜上，而且还出现于癌细胞胞浆中，这一现象提示，LN免疫反应物出现于胞浆很可能是良性肿瘤转化为癌的标志。因此，当肿瘤的性质判断困难时，进行瘤组织切片的LN免疫组织化学反应，有助于良恶性肿瘤的鉴别诊断。如果及时地干预LN的表达，有助于遏制肿瘤的恶性化倾向。本实验观察了LN在正常甲状腺组织、结节性甲状腺瘤与甲状腺癌中的阳性表达依次增加。本文观察甲状腺癌P 21WAF1  LI和LN的表达呈负相关（r=-0.610，P<0.05），提示P 21WAF1  LI和LN联合测定对鉴别良恶性甲状腺肿瘤有一定的临床价值。

　　参考文献
    
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　　作者单位:516001广东省惠州市中心人民医院病理科