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【摘要】 目的 选择血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、层粘蛋白（Laminin，LN）和纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）在大肠癌组织中的表达，探讨它们与大肠癌生物学行为的关系以及对大肠癌患者生存率的影响。方法 选择正常大肠组织10例，大肠癌70例。用美国Santa Gruz公司产的VEGF单克隆抗体和LN、FN的单克隆抗体，采用免疫组化SP法检测正常大肠组织和大肠癌组织中的VEGF、LN和FN的表达。VEGF、LN、FN在不同Dukes分期和癌细胞分化程度中的表达差异用χ 2 检验，对大肠癌生存率的影响用时序检验（Log-rank）检验。结果 VEGF免疫染色位于癌细胞的细胞质内，正常大肠粘膜中表达阴性。70例大肠癌组织中，47例VEGF免疫染色阳性。VEGF表达随DukesA-G增加而增加，并随分化程度下降而增高。VEGF表达与Dukes分期、癌细胞分化程度是一致的（P<0.01，P<0.05）。生存资料分析表明VEGF阳性者生存率低于VEGF阴性者，VEGF表达对大肠癌患者的生存率有非常显著性影响（P<0.01）。正常大肠粘膜有完整的基底膜，LN和FN强表达，间质中FN广泛表达。大肠癌组织基底膜中LN和FN有不同程度的减少，甚至完全缺失。间质中FN表达无明显变化。LN与FN在大肠癌组织中的表达与癌细胞分化程度一致（P<0.01，P<0.05）。LN表达随Dukes分期增高而减少（P<0.05），而FN表达与大肠癌Dukes分期无明显相关（P>0.05）。生存资料显示基底膜中LN的表达对大肠癌患者生存率有显著影响，而FN表达与大肠癌患者的生存率无明显相关。结论 VEGF作为一种特异性的促血管生成因子，在大肠癌的发生发展和自然病程中起重要作用，随Dukes分期的增高和癌细胞分化程度的降低其表达增加并影响患者的生存率;基底膜中LN和FN的表达随大肠癌细胞分化程度降低而减少，基底膜中LN的表达与Dukes分期相关，且影响患者术后生存率。检测大肠癌组织中VEGF和LN的表达有利于指导治疗和判断预后。
关键词 大肠癌 血管内皮生长因子 层粘蛋白 纤维连接蛋白 免疫组化
The expression of VEGF、LN and FN in colorectal cancer and their clinical implications
Xu Zhengchang
Department of Cancer Surgery，The81th Hospital of PLA，Jiangsu210002
【Abstract】 Objective To study the role of vascular endothelial growth factor（VEGF），laminin（LN）and fiˉbronectin（FN）in the biological behavior and survival in colorectal cancer.Methods 10normal colorectal mucosa and70colorectal cancer cases were examined.The expression of VEGF，LN and FN was examined in normal colorectal muˉcosa and colorectal cancer，using the monoclonal antibodies（produced by Santa Cruz，USA），with SP immunoperoxidase technique.Correlation between VEGF，LN，FN and the Dukes stage，degree of tumor differentiation was examined by chi-squre test。The prognostic value of VEGF，LN and FN expression in colorectal cancer was analyzed by using log-rank test.Results The VEGF immunostaining was localized in the cytoplasma of cancer cells.No reactivity was obˉserved in normal mucosa.The frequency of VEGF expression in70cases of colorectal cancer was67.1%，corresponding with Dukes stage and degree of differentiation.Analysis of survival data showed that the expression of VEGF had a signifˉicant effect on survival，in other words，the survival rate in VEGF positive group was lower than negative group.The norˉmal colorectal tissue had a continuous basement membrane and strong expression for LN and FN，stromal FN was exˉpressed in all the normal mucosa。The expression of LN and FN in basement membrane was decreased in colorectal canˉcer and was correlated with grade of tumor differentiation and LNwas correlated with Dukes stage，but the expression of stroma FN was not different from that in the normal mucosa.Extensive LN expression in basement membrane had better survival than cases with limited LN expression（P<0.01）.FN in the basement or stroma had no significant difference on survival（P>0.05）.Conclusion VEGF as a special angiogenesis factor，plays an important role in the occurece，develˉopment and natural course of colorectal cancer.The expression of LN in basement memberane is correlated with Dukes stare and differential grade and has an effect on survival.The expression of VEGF and LN in colorectal cancerwere helpˉful for clinicians to define prognosis and select appropriate type of therapy for the patients.
Key words colorectal cancer vascular endothelial growth factor laminin fibrorlectin immuno-histochemistry
大肠癌是最常见的肿瘤之一，而且其发病率呈上升趋势。大肠癌广泛浸润和远处转移是造成大肠癌死亡的主要原因。现代分子生物学研究表明大肠癌的浸润和转移有其复杂的分子生物学基础。本课题选择血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、层粘蛋白（Laminin，LN）和纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）在大肠癌组织中的表达，笔者所取的70例大肠癌标本均为我院肿瘤外科1994年1月～1995年12月间行大肠癌根治性手术切除的标本，经病理证实为大肠癌，另取正常大肠组织10例作为对照，以探讨它们与大肠癌生物学行为的关系以及对大肠癌患者生存率的影响。
1 资料与方法
1.1 临床资料 70例大肠癌标本均为81医院肿瘤外科1994年1月～1995年12月间行大肠癌根治性手术切除的标本，经病理证实为大肠癌，其中男39例，女31例，年龄25～70岁，平均年龄（54.5±13.2）岁。术前未经过任何化疗和放疗。标本均经福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，5μm连续切片，HE染色。另取正常大肠组织10例作为对照。
1.2 免疫组化染色 VEGF单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，免疫组化采用SP法，SP试剂盒为Maxim公司产品（购自福建迈新生物公司）。染色步骤:（1）连续切片，片厚5μm;（2）二甲苯脱蜡3次，每次15min，逐级酒精下行至水化;（3）1%H 2 O 2 15min灭活内源性过氧化物酶;（4）PBS洗3次，每次5min;（5）置0.05%胰蛋白酶液37℃消化30min;（6）PBS洗3次，每次5min;（7）滴加10%正常山羊血清15min抑制非特异性结合;（8）滴加一抗，4℃过夜;（9）PBS洗3次，每次5min;（10）滴加二抗（生物素化兔抗鼠IgG）;37℃孵育30min;（11）PBS洗3次，每次5min;（12）滴加复合物（链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶溶液），37℃孵育30min;（13）DAB显色液镜下显色;（14）苏木素复染，透明封片以PBS缓冲液代替一抗做阴性对照。
1.3 阳性判断 以细胞核、细胞质或细胞膜呈清晰棕色为阳性，VEGF染色按阳性细胞比例小于25%计为阴性，大于25%计为阳性。
1.4 统计学方法 用χ 2 检验比较VEGF在各组大肠癌中的表达，用时序检验（Log-Rank检验）检测VEGF的表达与术后生存率的关系，并绘出生存率曲线（Kaplan-Meier曲线）统计工作在SPSS8.0分析软件上完成。
2 结果
所有正常肠粘膜都有完整的基底膜，LN和FN染色阳性且完整，包绕整个腺体，间质中FN广泛着色。70例大肠癌组织的基底膜中，LN阴性者21例，LN弱阳性者28例，LN强阳性者21例;FN阴性者14例，弱阳性者32例，强阳性者24例。基底膜中LN和FN染色与大肠癌的Dukes分期和分化程度的关系，见表1。
表1 基底膜中LN和FN染色和大肠癌临床病理因素的关系 （略）
注:在不同Dukes期中，LN的表达差异有非常显著性，P<0.05;LN在不同分化的大肠癌中表达差异有显著性，P<0.01;FN在不同Dukes期表达差异无显著性，P>0.05;在不同分化的大肠癌中FN表达差异有显著性，P<0.05。DukesA期中LN（-）2例，LN（+）2例，LN（++）8例，DukesB期中LN（-）5例，LN（+）9例，LN（++）7例，DukesC期中LN（-）14例，LN（+）17例，LN（++）6例，经卡方检验LN在不同Dukes分期大肠癌中的表达差异有显著性，（P<0.05）;高分化癌中LN（-）2例，LN（+）5例，LN（++）6例，中分化癌中LN（-）7例，LN（+）16例，LN（+ +）12例，低分化癌中LN（-）12例，LN（+）7例，LN（++）3 例，卡方检验LN在不同组织学分级的大肠癌中的表达差异有非常显著性（P<0.01）。
DukesA期中FN（-）2例，FN（+）4例，FN（++）6例，DukesB期中FN（-）4例，FN（+）9例，FN（++）8例，DukesC期中FN（-）8例，FN（+）19例，FN（++）10例，经卡方检验FN在不同Dukes分期大肠癌中的表达差异无显著性（P>0.05）;高分化癌中FN（-）0例，FN（+）7例，FN（++）6例，中分化癌中FN（-）4例，FN（+）18例，FN（++）3例，低分化癌中FN（-）10例，FN（+）7例，FN（++）5例，卡方检验FN在不同组织学分级的大肠癌中的表达差异有显著性（P<0.05）。本组大肠癌标本间质中FN呈普遍阳性表达，未见明显缺失或增多，且与大肠癌分化和Dukes分期无关。
结合对62例患者的随访资料，采用时序检验法（Log-rank检验）比较基底膜中LN和FN的沉积对患者生存率的影响。生存曲线见图1，图2。结果发现:基底膜中LN表达完整者生存要好于LN表达缺失者，而基底膜中FN的表达对生存无明显影响。
2.1 正常大肠组织中无明显VEGF阳性表达 大肠癌组织中，VEGF主要位于癌细胞质内，癌细胞周围的微血管内皮细胞呈阳性反应。70例大肠癌中阳性者47例，占67.1%，阴性者23例，占32.9%。
2.2 VEGF表达与Dukes分期的关系 DukesA期中VEGF表达阳性者4例，占33.3%，DukesB期中VEGF表达阳性者12例，占57.1%，DukesC期中VEGF表达阳性者1例，占83.8%，经卡方检验VEGF在不同Dukes分期大肠癌中的表达差异有非常显著性，P<0.01，VEGF阳性表达与Dukes分期呈负相关。VEGF表达与Dukes分期的关系，见表2。
表2 VEGF表达与大肠癌Dukes 分期的关系（略）
2.3 VEGF表达与癌细胞分化的关系 高分化癌中VEGF表达阳性者6例，占46.1%，中高分化癌中VEGF表达阳性者22例，占62.9%，低分化癌中VEGF表达阳性者19例，占86.4%，卡方检验VEGF在不同组织学分级的大肠癌中的表达差异有显著性P<0.05。VEGF表达与大肠癌细胞分化的关系，见表3。
表3 VEGF表达与癌细胞分化的关系（略）
2.4 VEGF表达与大肠癌预后的关系 在取得随访资料的62例患者中，VEGF表达阳性者42例，23例死亡，病死率为54.8%;VEGF表达阴性患者20例，5例病死，死亡率为25%。生存曲线（Kaplan-Meier曲线），见图3。
结合患者的随访资料，对VEGF阳性和VEGF阴性组进行随访，生存率经时序检验（Log-rank检验）结果显示，VEGF阳性组患者术后生存率明显低于VEGF阴性组（P<0.01），说明VEGF的表达可作为大肠癌患者的预后指标。
3 讨论
大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，早期诊断率低，且术前常常已有难以发现的微小转移，因此术后复发和转移成为临床上亟待解决的难题。研究证明肿瘤的生长和转移依赖于血管形成，无血管形成时，肿瘤亦无转移现象发生 ［1］ 。血管生成是指从已存在的毛细血管或毛细血管后微静脉产生新血管的过程，自20世纪70年代Folkman提出肿瘤血管形成的概念以来，越来越多的研究表明肿瘤血管形成是肿瘤生长和转移的重要条件之一。
VEGF属生长因子PDGF家族，是1989年Ferrara等 ［2］ 从牛垂体滤泡星状细胞培养物中分离到的一种肝素结合因子，因其特异性作用于内皮细胞，引起内皮细胞增殖，并在体内诱导血管形成而被命名为血管内皮生长因子，即VEGF。VEGF由2个相同分子量的亚基以二硫键结合的糖蛋白二聚体。近年在解释肿瘤细胞侵袭性生长失控时，VEGF的旁分泌作用得到高度重视。肿瘤血管期的启动是由瘤细胞产生的促内皮细胞增殖和迁移的血管生成因子所诱发，其中以VEGF最为重要。VEGF选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的受体，一般认为只有血管内皮细胞表达VEGF受体。VEGF与其受体结合后，其生物学效应是增加微血管特别是毛细血管后静脉和小静脉的渗透性，这对于血管生成前的肿瘤营养是极其重要的:促进不同来源内皮细胞分裂增殖和血管构建的作用，促使内皮细胞、单核细胞的迁移，诱发新血管生成 ［2］ ，这对肿瘤的生长、浸润和转移有重要影响。研究认为，VEGF改变了内皮细胞基因的活化形式，上调了uPA和tPA以及PAI-1的表达，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子，即诱导了血管生成。VEGF表达的调控较为复杂，突变的ras癌基因可上调VEGF的表达，ras表达蛋白抑制剂能明显降低VEGF的活性。VEGF在健康人组织中仅维持正常的血管密度和基本的渗透功能，以利于营养物质的运输，许多人类肿瘤如成骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌和纤维肉瘤、结肠癌、肾癌和嗜铬细胞瘤细胞都有较高水平的VEGF分泌，其表达均高于正常组织和良性肿瘤组织。并且研究发现VEGF的表达与一些肿瘤的预后密切相关。本组资料显示，大肠癌VEGF的表达比正常粘膜上皮细胞明显增高，主要表达于癌细胞，且表现出明显的异质性，阳性癌细胞附近小血管阳染，提示VEGF主要由癌细胞产生和分泌，并作用于附近的血管。从Dukes A期至C期，VEGF阳性表达率增加，说明VEGF的表达与大肠癌的进展和淋巴结转移相关。这提示VEGF是大肠癌中一种很重要的促血管生长因子，对大肠癌的生长转移很重要，大肠癌的进展需要VEGF诱导的血管形成以提供癌细胞需要的氧和养分。VEGF与癌细胞的分化程度亦明显相关，低分化癌中VEGF的表达明显高于中、高度分化癌，说明不同分化程度的的大肠癌VEGF表达的能力亦不同。随访资料显示:VEGF的表达与大肠癌生存率呈明显负相关（P<0.01）:VEGF阳性者，生存率低于VEGF阴性者，表明VEGF与大肠癌的复发转移和生存期缩短有关。因此，VEGF在大肠癌组织中的过度表达可作为判断患者预后的一个指标。
本组研究提示笔者VEGF对大肠癌的生长转移很重要，临床上可进一步制备相应的VEGF抑制剂，抑制大肠癌的生长和转移，以延长大肠癌患者的生存期。肿瘤细胞广泛浸润和远处转移是造成大肠癌患者死亡的主要原因，也是大肠癌临床治疗中的难题。癌细胞的浸润和远处转移是一个主动的过程，首先，癌细胞穿破基底膜，穿过肿瘤细胞周围基质，进而侵犯血管和淋巴管，随血液循环到远处脏器定位 ［3］ 。基底膜是上皮细胞间或上皮细胞与临近结缔组织的分界面，为癌细胞侵袭过程中遇到的主要屏障。基底膜主要由IV型胶原形成一种三维网状结构，并与LN和FN等连接形成细胞外基质结构，其中LN和FN是高分子量的非胶原性糖蛋白。研究发现:肿瘤细胞粘附基底膜主要由LN介导，并且发现肿瘤细胞与LN接触后癌细胞能分泌一些蛋白水解酶使局部基质降解，进而实现浸润;另外，蛋白水解片段不仅可以促进癌细胞分泌更多的蛋白水解酶，还能诱导细胞的迁移、增殖、血管形成的一系列生物效应 ［4］ 。
有关癌组织中基底膜物质的来源尚无定论，一些研究表明癌组织中的基底膜成分可能是由癌细胞合成的，且活动性癌细胞低于静止性癌细胞。本组实验发现大肠癌细胞质中有FN的阳性表达，提示癌细胞具有合成基底膜成分的能力。本组实验发现在正常大肠癌组织中有完整的基底膜，腺细胞与基质交界处有完整的LN和FN沉积，而大肠癌组织中有不同程度的缺失。高分化癌大部分基底膜是连续完整的，而在低分化癌中多不完整，LN和FN在低分化癌的表达明显低于高、中分化者，P<0.05，这与部分笔者报道一致，可能是由于低分化癌细胞合成分泌LN及FN的能力减弱或低分化癌组织内的细胞分泌蛋白水解酶的活性较高 ［5，6］ 。这也从一个侧面说明为什么低分化癌恶性程度高，而高分化癌恶性程度低。
LN利FN是否与癌侵袭转移相关一直存在着争论，如有学者认为基底膜LN的缺失与淋巴结转移密切相关，亦有研究表明LN及FN与癌的侵袭转移均无关。笔者的研究发现:LN与Dukes分期有关，随Dukes分期增高LN表达减少（P<0.05），但不同Dukes分期中FN的阳性表达差异无显著性（P>0.05）。LN作为基间膜的重要组成成分，可能在限制大肠癌细胞向周围的浸润转移方面起一定的作用。本组资料显示FN在大肠癌侵袭转移中不起主要作用。随访资料显示:基底膜中LN沉积与大肠癌术后的生存率呈明显负相关（P<0.01），LN表达完整者，生存率优于LN缺失者，说明LN是限制癌细胞浸润和转移的重要屏障。基底膜及间质中FN的表达与大肠癌术后的生存率无明显相关（P>0.05）
4 结论
（1）大肠癌中VEGF阳性表达率高，提示VEGF在大肠癌的发生发展中起一定的作用。（2）VEGF在大肠癌中的表达与癌细胞分化程度明显相关，低分化大肠癌中VEGF表达明显高于高、中分化者（P<0.05）;而且随Dukes分期的增高，VEGF阳性表达增多（P<0.01），说明VEGF与大肠癌细胞恶性度增高和癌细胞浸润和转移性增强相关。（3）大肠癌组织中VEGF的表达对大肠癌患者生存率有显著影响，VEGF表达阴性患者预后明显好于VEGF表达阳性患者，因此VEGF可作为判断大肠癌预后的良好指标，且可能为临床对于患者治疗措施的制定提供参考。（4）在正常大肠组织中，有完整的基底膜，LN和FN强表达，间质中FN广泛表达。而在大肠癌组织中，基底膜LN和FN呈不同程度的减弱，间质中FN的表达未见明显变化。（5）基底膜中LN和FN在大肠癌组织中的表达与癌细胞的分化程度相一致，恶性程度高者LN和FN表达减弱;LN的沉积随Dukes分期的增高而减少，提示LN在限制大肠癌的侵袭转移方面起一定的作用。（6）大肠癌基底膜中LN的沉积对大肠癌患者生存率有明显影响，可以作为判断预后的良好指标。
（本文图片见附页1） （略）
参考文献
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（收稿日期:2004-08-23）
（编辑唐 城）
作者单位:210002江苏解放军第81医院肿瘤外科