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1 临床表现、病理改变及影像学特征
1.1 临床表现 该病常起病于青少年，表现为神经、精神症状、肝脏症状以及角膜铜沉积而表现为Kayser-Fleischer环或这些症状的任何组合。成人神经症状以运动减少、肌强直为主，可见不规则的位置性震颤、共济失调和构音障碍等。精神症状 ［1］ 可见自主神经功能紊乱、肌肉紧张、易疲劳、性兴趣减低、情绪反应缺乏、精力不集中、睡眠减少、疼痛、悲观和记忆力减退。后期呈现明显痴呆。有的出现精神分裂症状表现 ［2］ 。少数成人病例患慢性肝炎而始终不呈现神经症状。儿童期发生的神经症状则以舞蹈、手足徐动和肌张力不全性动作为主。少数儿童死于暴发性肝炎。少见的临床表现有睡眠过度、旋转发作（circling seizures）并额叶自动症 ［3］ 、特发性血小板减少性紫癜、地中海贫血及因子V缺乏。Kawahara等 ［4］ 报道1例16岁女孩，因溶血性贫血收住院。检查发现血总胆红素浓度（1.46mg）升高，血浆结合珠蛋白浓度低于10mg/dl。血涂片见大量泪珠样细胞（tear drop red cells）及少量棘球细胞。其血清铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CP）为4mg/dl，尿铜345μg/dl，肝活检铜含量为干重535μg/g，湿重183μg/g。家族史（+）。说明WD的铜代谢障碍可造成病人的溶血性贫血及红细胞畸形，Yuce等 ［5］ 报道4例血清CP正常的WD患儿表现为肝脏症状，无Kayser-Fleischer环，但尿铜排泄增加，肝铜含量升高。有明确的家族史。
1.2 病理特征 Bertrand等 ［6］ 对7例WD病人活检脑组织进行病理学研究。在所选择的7个脑区中对AlzheimerⅠ和Ⅱ型细胞（AlzⅠ和Ⅱ）以及组织游走细胞（Opalski cells，Opl）进行定量分析。AlzⅠ和Ⅱ型细胞用HE染色、Opl细胞用PAS染色。结果:3种细胞中，AlzⅡ型细胞数目最多，AlzⅠ型细胞数目最少。AlzⅠ主要分布在壳核，AlzⅡ则分布广泛。AlzⅠ型细胞仅见于神经病型WD，AlzⅡ型细胞在肝脏数量最多，Opl细胞则见于“神经病”混合型。并且神经病型WD的组织损伤较重伴有坏死。肝型WD的脑组织呈广泛的海绵状改变，不伴有坏死。这些结果说明病理性星形细胞的数量和类型与WD的临床类型及组织损伤的程度有关。AlzⅡ型细胞似乎是对致病因子的早期星形细胞反应的特征性表现，而AlzⅠ和Opl细胞则仅出现在WD组织损伤的发展过程中。
1.3 影像学特征 Alaen等 ［7］ 应用T 2 弛豫时间和MR质子光谱（proton spectroscopy，1H-MRS）获取脑和肝的MRI。4例WD同胞中1例有临床症状，3例无症状。结果肝T 2 值与活检的结果有相关性，但与对照组相比无差别。4例脑MRI均不正常，有临床症状者见后丘脑的高信号区、弥漫性脑萎缩和桥脑中心性髓鞘溶解。Troncoso ［8］ 报道1例13岁女孩和1例12岁男孩的脑CT和MRI检查结果，基底节和其它深部灰质核团严重受损，认为应与“儿童的纹状体坏死”相鉴别。
1.4 WD与妊娠 有人认为，如果在孕前无并发症，接受治疗的WD病人应有正常的怀孕与分娩。Messner等 ［9］ 报道1例22岁妇女，肝活检确诊为WD予青霉胺治疗。其肝肾功能正常，无神经精神症状，分别经38+1周和38+2周分娩体重3100g和3940g的两个男婴，均经母乳喂养3个月以上，除了婴儿黄疸期延长外，未见其他不良反应。但有作者认为，金属螯合剂如青霉胺有致畸作用，对WD的妊娠应持慎重态度。
2 基因定位研究进展
2.1 WD基因定位于突变研究及其与临床的关系 目前已明确，WD基因位于染色体13q14.3，包含21个外显子，20个内含子，全长约80kb，转录产物为7.5kb，cDNA全长编码一种1465个氨基酸的铜转运P型ATP酶（ATP7B），故又称ATP7B。基因ATP7B参与铜跨膜转运的代谢过程，在结构上分3个区域:（1）金属离子结合区（Cu1-Cu6）;（2）P型ATP酶功能区，又称高度保守区，包括磷酸酶活性区和磷酸化区;（3）跨膜区（Tm1-7），又称疏水区。WD具有明显的遗传异质性。基因突变研究表明 ［10，12，13］ ，至今已发现200多种病变可引起WD基因的突变，这些突变以点突变为主，通常累及ATP7B的功能区，而不是金属结合区，包括错义和无义突变、小缺失、小片段缺失、小插团入，调节基因突变，剪接突变，漂移突变以及插入和缺失同时存在等。欧美国家和亚洲国家的WD基因突变热区有明显的不同。
Duc等 ［11］ 对33例德国和10例古巴WD患者及其同胞进行检测，发现His1069Gln在所有德国家庭中占42%，并发现单体型C（holotype C）对这些突变具有高度的预测性。His1069Gln的纯合子病人表现出了几乎所有的临床表现。Loudlianos等 ［12］ 对南斯拉夫35例WD病人进行研究，采用单链构象多态分析（SSCP）继以DNA测序的方法，发现11种突变，其中3个为新发现的突变类型。占WD染色体71.3%的分子缺陷为H1069Q（48.9%）、2304～2305insC（11.4%）、R616Q（5.7%）和A1003T（5.7%），分别位于14、8、5和13号外显子。
王柠等 ［13］ 的研究证实中国人该病基因突变热区为8号外显子Arg778Leu/Gln和12号外显子Thr935Met，突变率分别为30.7%和6.8%。吴志英等 ［14］ 采用PCR-SSCP及DNA测序的方法对ATP7B的基因突变进行检测，18例病人为常见的Arg788Leu纯合突变，29例在1条染色体上存在Afrg788Leu杂合错义突变。认为携带Arg788Leu纯合突变的患者和携带Arg788Leu杂合突变的患者，其发病年龄较小（P<0.05），血清CP水平明显降低（P<0.001）。前者与WD早期出现肝脏症状有关，Arg788Leu突变对ATP7B功能有严重影响，可导致患者出现症状较早并较严重。2.2 分子机制的探讨 Schacfer等 ［15］ 应用免疫印迹法（imˉmunoblot analysis）从人和大鼠肝细胞溶解产物中检测到一种165Kda的蛋白质，免疫荧光法证实这种蛋白质位于肝细胞的跨高尔基网（trans-Golgi network），但在低肝铜浓度时不存在，给铜后这种蛋白质重新分布在靠近肝内胆小管膜的囊泡内。这与WD蛋白质（ATP7B）在全铜蓝蛋白（holoceruˉloplasmin）的合成和胆道泌铜中的作用相符合。
Forbes等 ［11］ 根据ATP7B能够修复与铁摄取有关的酵母突变型CCC2而设计了一种酵母互补测定法（a yeast comˉplementation assay），在ATP7B的cDNA中发现了10种突变，其中7种公认的WD突变体至少可部分的与CCC2的突变体互补，提示它们仍保留一些转运铜的能力。ATP7B中的半胱—脯—半胱氨酸基本型（cysteine-proline-cysteine moˉtif，CPC）突变产生无功能的蛋白质，证明CPC对ATP7B转运铜的功能是必需的。
细胞内铜释放到特定部位需要特殊的细胞间转运蛋白质做工具，这种蛋白质称为铜蛋白结合体（copper chaperˉone）。人类铜蛋白结合体HAH 1 在把铜转运到分泌通路的过程中起重要作用。HAH 1 为单链蛋白质，遍布于整个细胞浆和细胞核中。在体内应用协同免疫测定（coimmunoprecipˉitation）实验显示HAH 1 与WD蛋白和Menkes蛋白质均有相互作用，这一作用依赖于可利用的铜。用WD氨基末端相关的突变型重复上述实验，可观察到两者与HAH 1 的作用显著减弱，提示HAH 1 的铜释放障碍是包含有这些突变的WD的分子基础 ［16］ 。
3 诊断方法的研究
3.1 基因诊断技术 根据临床表现和铜、CP的生化检测进行WD症状前诊断及杂合子检测存在很大困难。而组织杂合子之间的婚配，防止患儿的出生，对提高民族素质具有重要意义。限制性片段多态分析（restrictive fragment length polymorphism，RFLP）为其提供了基因诊断技术。近年来出现了微卫星（short tandem repeat，STR）标记分析法，推进了WD基因诊断技术的发展。王丽娟等 ［17］ 应用WD基因内及侧翼的5个STR（CD13S301，D13S296，AFM238vc3和AFMO84xc5）对23个WD家系的120名成员进行单体型分析，PCR扩增片段长度多态性—聚丙烯酰凝胶电泳（AFLP-PAGE）的结果显示2例拟诊患者得到确诊，31例同胞中，检出肯定的症状前患者4例，杂合子8例，正常人7例，可疑患者2例。作者认为STR单体型可提供高信息量的遗传诊断信息，为WD基因诊断提供了重要的新途径。
3.2 其它 WD是一种可治的遗传代谢病，其预后取决于肝和神经系损伤的程度。故建立一个症状前的人群筛选方法具有重要意义。Yamaguchi等 ［18］ 用一种全铜蓝蛋白特异性单克隆抗体对126，810名新生儿进行筛查，结果未见到阳性病例。但在婴儿晚期至小学一年龄
的24165名儿童中查到3例病人，作者认为3岁是WD筛选的最佳年龄点。Merli等 ［19］ 则应用稳定同位素 65 Cu口服试验对一WD家庭（包括父母及4个子女）进行检查，其中20岁男孩和17岁女孩有肝硬化表现。全部家庭成员一次性口服 65 Cu3mg，分别在0、1、2、6、24、48和72h采血测定 64Cu: 63 Cu的血清比值。结果，2个有症状的WD成员得到肯定。另2个子女被排除WD诊断。随后进行的基因分析与上述结果相符。作 者认为 65 Cu口服试验是一种安全的非侵入性诊断方法，尤 其对诊断困难或症状前病人。但是阳性结果必须经肝活检证实铜的堆积，因为杂合子病人可有严重的铜代谢障碍而无临床表现，结合基因诊断对大量的杂合子病人有用。
4 基因治疗
随着WD基因的进一步分离和完整克隆，人们尝试开展WD基因的替代治疗，设想通过基因工程将具有正常功能的ATP7B的cDNA逆转录，使其在细胞内表达正常的产物，从而达到治疗的目的。La-Fontaine等 ［20］ 把正常人的Menkes蛋白（ATP7A）的cDNA和鼠的ATP7B同源基因Atp7b的cDNA分别转染到一种来自于Menkes病病人的成纤维永生细胞系中，从其质粒结构中表达的ATP7A和ATP7B均能减轻铜的堆积和改善这些细胞的铜潴留表现型。然而，这2种蛋白质对于细胞外铜的升高有不同的反应。尽管ATP7A表现为从跨高尔基网向胞浆膜的转移，但是在同一细胞系中，ATP7B在细胞内的位置似乎不受铜水平升高的影响。基因治疗的研究将随着基因工程技术的进步得到进一步的发展和完善，并取得令人可喜的效果。
5 问题与展望
WD基因及其表达产物的深入研究，对于进一步了解WD的发病机制，基因诊断及治疗的发展均具有重要意义。尤其是当前利用基因诊断技术对症状前病人作出早期诊断以及出生前诊断，防止WD患儿的出生，具有非常重要的实际意义。基因工程技术的进一步发展，将为彻底解决WD开辟广阔的前景。
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作者单位:274001山东省菏泽市立医院分院