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【摘要】 目的 FHIT基因包含着FRA3B脆性位点，位于3p14.2染色体，是一个与乳腺癌等大多数肿瘤相关的候选抑癌基因。本实验研究通过检测乳腺癌及其癌旁组织石蜡切片中Fhit蛋白的表达水平，来探讨FHIT基因的低表达或缺失与临床病理分期的关系。方法 应用免疫组织化学S-P法对99例乳腺癌组织及其癌旁组织标本（其中临床病理分期:0期15例，Ⅰ期9例，Ⅱ期57例，Ⅲ期15例，Ⅳ期3例）行Fhit蛋白表达水平检测，观察FHIT基因在癌组织中的低表达或缺失情况与临床病理分期的关系。结果 0期乳癌Fhit蛋白低表达率26.67%（4/15）与Ⅰ期乳癌Fhit蛋白低表达率55.56%（5/9）比较，差异无显著性（四格表精确检验法P=0.132<1.963，P>0.05）;Ⅰ期乳癌Fhit蛋白低表达率55.56%（5/9）与Ⅱ期乳癌Fhit蛋白低表达率66.67%（38/57）比较，差异无显著性（χ 2 =0.075<χ 20.05（1） =3.841，P>0.05）;Ⅱ期乳癌Fhit蛋白低表达率66.67%（38/57）与0期乳癌Fhit蛋白低表达率26.67%（4/15）比较，差异有非常显著性（χ 2 =7.817> 20.01（1） =6.635，P<0.01）。Ⅱ期乳癌Fhit蛋白低表达率66.67%（38/57）与Ⅲ～Ⅳ期乳癌Fhit蛋白低表达率94.44%（17/18）比较，差异有显著性（χ 2 =4.071>χ 20.05（1） =3.841，P<0.05）。0～Ⅰ期乳癌Fhit蛋白低表达率37.5%（9/24）与Ⅱ期以上乳癌Fhit蛋白低表达率73.33%（55/75）比较，差异有非常显著性（χ 2 =10.215>χ 20.01（1） =6.635，P<0.01）。结论 Fhit抑癌基因表达强度的下降与乳腺癌的临床病理分期相关。
关键词 乳腺癌 癌旁组织 Fhit基因
Loss of fragile histidine triad expression and clinical stages in breast cancer
Ding Yu，Wang Xinmei，Niu Guangming
Dept.of General Surgery，Central Hospital of Zibo City，Shangdong255036.
【Abstract】 Objective The FHIT gene，encompassing the FRA3B fragile site at chromosome3p14.2，is a candidate tumor suppressor gene involved in multiple tumors，including breast cancer.We analyzed FHIT expression using an immunohistochemical method in paraffin sections of99breast cancer to investigate the relationship between the expression and clinical stages.Methods Using citrate-microwave-Streptavidin-HRP（SP）immunohistocheˉmical method，detect Fhit protein expression in99cases of formalin-fixed，paraffin-embeded breast cancer composed of15cases of clinical stage0，9cases of stageⅠ，57cases of stageⅡ，15cases of stageⅢ，3cases of stageⅣ.To investigate the relationship between the lower expression of FHIT gene and clinical stages.Results There was a sigˉnificant difference in the expression of Fhit between the breast cancers of clinical0stage andⅡstage，Ⅱstage andⅢ～Ⅳstage.There was no significant difference in the expression of Fhit between the cases of0stage and the cases ofⅠstage.Conclusion The expression of Fhit is associated with clinicopathological stage of tumor in breast cancer.
Key words mammary cancer tissue adjacent to cancer FHIT gene
脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad，FHIT）基因位于人类染色体3p14.2，是Ohta ［1］ 等在1996年用外显子捕获法（exon trapping）克隆确定的一个候选抑癌基因，依据其cDNA推测的蛋白质———脆性组氨酸三联体蛋白（pFHIT）和具有三价组氨酸结构域的HIT蛋白具有高度同源性，故将其命名为FHIT。人们已在多种人类原发肿瘤组织和细胞系中发现FHIT基因的缺失，FHIT基因的改变可能与多种肿瘤的发生、发展相关。研究各种肿瘤组织中FHIT基因和功能的改变及其与肿瘤发生、发展的关系是近年来分子肿瘤学研究的热点之一。但有关乳腺癌组织中Fhit蛋白表达情况的研究报道甚少。Mao ［2］ 等研究了54例Ⅰ级乳腺导管癌和9例乳腺原位癌，发现有较高频率的FHIT基因缺失;赵坡 ［3］ 等对66例乳腺导管癌的研究发现，Fhit蛋白低表达可能与癌组织浸润及淋巴结转移相关;Hayashi ［4］ 等研究了61例乳腺癌的FHIT基因异常转录与临床病理特征的关系，结果表明FHIT基因异常转录与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、雌、孕激素受体、局部转移、乳腺癌家族史及病人的生活习惯（吸烟、饮酒）等无关。本实验研究应用免疫组织化学S-P法对99例乳腺癌及其癌旁组织中的Fhit蛋白表达强度进行检测，来推测组织中FHIT基因的缺失情况，以探讨FHIT基因与临床病理分期的可能关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 2001年5月～2003年6月间山东省淄博市中心医院普外科手术切除经病理证实的乳腺导管细胞癌标本99例。术前未经放、化疗，经常规福尔马林固定，石蜡包埋，3μm连续切片。根据国际抗癌协会建议的T（原发癌瘤）、N（区域淋巴结）、M（远处转移）分期法（1988年修订），再根据T、N、M情况进行组合，可把本文乳腺癌标本分为以下各期:0期15例，Ⅰ期9例，Ⅱ期57例（有淋巴结转移者32例，无淋巴结转移者25例），Ⅲ期15例（有淋巴结转移者15例），Ⅳ期3例（其中T 3 N 2 M 1 1例，T 3 N 1 M 1 1例，T 3 N 3 M 1 1例）。
1.2 主要试剂 兔抗人FHIT多克隆抗体一抗工作液、SP9000通用型免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、多聚赖氨酸粘片剂、PBS液（pH7.2～7.4）、枸橼酸盐缓冲液（pH=6）均购自北京中山生物技术有限公司。主要仪器:德国LEICA RM2315型切片机、LEICA TP1020型脱水机、常州中成电子仪器厂的病理组织漂烘处理仪、超净工作台（环境温度要求18～20℃）。
1.3 方法 应用免疫组织化学链霉素亲生物素-过氧化酶法（S-P法）对99例乳腺癌组织及其癌旁组织标本进行Fhit蛋白的表达水平检测。主要实验方法和步聚如下:将标本3μm切片脱蜡至水化，在3%过氧化氢室温下孵育10min（灭活内源性过氧化物酶活性），热抗原修复，滴加封闭用蓝色正常血清工作液，依次滴加FHIT一抗工作液，滴加黄色生物素化二抗工作液（IgG/Bio），滴加橙色辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），DAB显色，苏木素染色，脱水透明，封固。
1.4 结果判定 参考近期国外文献 ［5］ 方法观察Fhit蛋白的分布、阳性强度和阳性率。先按染色强度打分:0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背影着色相对比;再按阳性细胞数所占全部细胞总数的百分比打分:0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%，染色强度与阳性细菌百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性（+）。每张切片在400倍显微镜下选定10个视野，计算阳性细胞百分数。并以已知的阳性乳腺组织切片（北京中山公司提供）作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。比较癌组织与癌旁组织的染色反应来确定Fhit蛋白表达状况。
1.5 统计学处理 χ 2 检验法，U检验。
2 结果
2.1 Fhit蛋白在乳腺癌及癌旁组织中阴性表达率和低表达率的比较 99例乳腺导管细胞癌组织中Fhit蛋白表达强度为阴性者19例，阴性表达率19.19%（19/99），癌旁组织中Fhit蛋白表达强度为阴性者8例，阴性表达率8.08（8/ 99），两组之间差异有显著性（U=2.278>1.96，P<0.04）。乳腺癌组织中Fhit蛋白表达强度较癌旁组织低者64例（64.65%，64/99），乳腺癌组织中Fhit蛋白表达强度较癌旁组织高者4例（4.04%，4/99），与癌旁组织相等者31例（31.31%，31/99）。癌组织Fhit蛋白低表达率（64.65%）与癌旁组织Fhit蛋白低表达率（4.04%）之间差异有非常显著性（U=8.98>2.58，P<0.01），见表1。
表1 癌组织与癌旁组织中Fhit蛋白表达率的比较 （略）
2.2 Fhit表达与乳腺癌临床病理分期的关系 99例乳腺导管癌中，0期乳腺癌癌组织中Fhit蛋白呈低表达者4例，低表达率26.67%（4/15）;Ⅰ期乳腺癌Fhit蛋白呈低表达者5例，低表达率55.56%（5/9）;Ⅱ期乳腺癌Fhit蛋白呈低表达者38例，低表达率66.67%（38/57）;Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌Fhit蛋白呈低表达者17例，低表达率94.44%（17/18）。0期乳腺癌Fhit蛋白低表达率26.67%（4/15）与Ⅰ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率55.56%（5/9）比较，差异无显著性（四格表精确检验法P=0.132，P>0.05）;Ⅰ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率（55.56%，5/9）与Ⅱ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率（66.67%，38/57）比较，差异无显著性（χ 2 =0.075<χ 20.05（1） =3.841，P>0.05）。Ⅱ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率（66.67%，38/57）与0期乳腺癌Fhit蛋白低表达率（26.67%，4/15）比较，差异有非常显著性（χ 2 =7.817>χ 20.01（1） =6.635，P<0.01）。Ⅱ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率（66.67，38/57）与Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率（94.44%，17/18）比较，差异有显著性（χ 2 =4.071>χ 20.05（1） =3.841，P<0.05）。0～Ⅰ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率（37.5%，9/24）与Ⅱ期以上乳腺癌Fhit蛋白低表达率（73.33%，55/75）比较，差异有非常显著性（χ 2 =10.215>χ 20.01（1） =6.635，P<0.01）（详见表2-1、2-2）。
表2-1Fhit蛋白低表达率与乳腺癌临床病理分期的关系 （略）
3 讨论
在正常情况下，FHIT基因存在于大多数正常组织中。国外发现多种肿瘤组织中Fhit蛋白表达存在频繁的降低或缺失，并发现与FHIT基因转录异常或缺失有关，故提示FHIT基因为多种肿瘤的候选抑癌基因。FHIT（脆性组氨酸 三联体）基因是第一个将脆性位点与肿瘤联系起来的抑癌基因。1979年Cohan ［6］ 等观察到一个意大利家族中出现遗传性早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌与3p14.2和8q24的易位有关。其后，相继在头颈部肿瘤、肺癌等许多肿瘤细胞系中尤其是鳞癌中发现存在于人类3号染色体的高频率等
表2-2 Fhit蛋白低表达率与乳腺癌临床病理分期的关系 （略）
位基因缺失，提示3p上存在未知等位基因。胡楠 ［7］ 等发现在食管癌患者及其家族成员的外周血中3p14.2是最常见的脆性位点。Clover等发现3p14.2区域含有最常见的可被α-DNA多聚酶抑制剂蚜肠霉素（apaphidicolin）诱导的脆性部位FRA3B，进一步提示3p14.2在肿瘤发生中的作用。此外，在许多肿瘤研究中，测定序列标记位点（sequence-tagged site，STS）发现3p14.2区域存在多种DNA片段的缺失，强烈提示3p14.2区域可能存在一个重要的抑癌基因。1996年Ohta ［1］ 等在3p14.2克隆并确定了FHIT基因。FHIT基因位于人类染色体3p14.2，此区包含家族性肾细胞癌t（3;8）易位断裂点和脆性部位FRA3B，它是组氨酸三联体（histidine triad，HIT）基因家族成员之一，其cDNA全长1095bp，编码一个由147个氨基酸组成的16.8KD的人二腺苷酸三磷酸水解酶（Fhit）。从结构和功能上看，Fhit是一个典型的二核苷酸5’-5’’’-p1，p3三磷酸（Ap 3 A）水解酶（EC3.6.1.29），Ap n A又是参与细胞内增殖和凋亡信号传导的重要因子。Ishii等 ［8］ 在1996～2001年间进行了有关FHIT基因在原发肿瘤组织中表达情况的研究，结果发现有60%（1162/1948）的病例标本存在Fhit蛋白的表达缺失或低表达，癌前病变或早期癌中，Fhit蛋白表达缺失或低表达率从0～93%不等，平均为31%（127/408），认为FHIT基因至少在一部分恶性肿瘤中是一种典型的抑癌基因。目前的研究结果表明，FHIT基因结构及表达异常见于多种类型的肿瘤细胞株和原发瘤组织，包括肺癌、乳腺癌、头颈部癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌以及食管癌等。Hayashi ［4］ 等研究了61例乳腺癌的FHIT基因异常转录与临床病理特征的关系，结果表明FHIT基因异常转录与年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、雌激素受体、孕激素受体、局部转移、乳腺癌家族史及病人的生活习惯（吸烟、饮酒）等无关。而Michael ［9］ 等用RT-PCR的方法研究FHIT基因在正常食管、Barrett’s癌前病变、食管腺癌中的表达，结果在食管腺癌中FHIT和FRA3B发生高频率的缺失（缺失率为93%，14/15），Barrett’s癌前病变亦发生高频率的缺失（缺失率为86%，12/14），表明在食管肿瘤的早期癌前病变阶段可以见到FHIT转录异常，认为FHIT基因表达异常在食管癌 发生的早期是个共同事件。Kitamura ［10］ 等通过免疫组织化学的方法研究了Fhit蛋白在75例食管鳞状细胞癌石蜡标本中以及在侵袭性癌、原位癌和异常增生组织中的表达，结果发现随着病理组织学变化的加重，Fhit表达呈进行性减少或缺失（P<0.01）。
本实验99例乳腺导管癌中，0期乳腺癌Fhit蛋白低表达率26.67%（4/15）与Ⅰ期乳腺癌Fhit蛋白低表达率55.56%（5/9）比较，差异无显著性（四格表精确检验法P=0.132，P>0.05）;Ⅰ期乳腺癌（55.56%，5/9）与Ⅱ期乳腺癌（66.67%，38/57）比较，差异无显著性（χ 2 =0.075<χ 20.05（1） =3.841，P>0.05）;Ⅱ期乳腺癌（66.67，38/57）与0期乳腺癌（26.67%，4/15）比较，差异则具有非常显著性（χ 2 =7.817>χ 20.01（1） =6.635，P<0.01）.Ⅱ期乳腺癌（66.67%，38/57）与Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌（94.44%，17/18）比较，差异也具有显著性（χ 2 =4.071>χ 20.05（1） =3.841，P<0.05）。0～Ⅰ期乳腺癌（37.5%，9/24）与Ⅱ期以上乳腺癌（73.33%，55/75）比较，差异有非常显著性（χ 2 =10.215>χ 20.01（1） =6.635，P<0.01）。这一结果与Kitamura的发现基本相符合。
综上所述，关于FHIT基因与乳腺癌临床病理特征关系方面的研究，国内外有关报道还较少。FHIT表达下降可能与乳腺癌的发生、发展、临床病理分期、癌组织浸润、淋巴结转移有关，而与病人年龄、淋巴结转移数量、雌激素受体、孕激素受体、C-erbB 2 无明显关系。FHIT基因表达产物Fhit蛋白可能是一种重要的肿瘤抑制基因蛋白，在乳腺癌的发生和演化中起着重要作用。Fhit蛋白用免疫组织化学方法易于检测，因此可能成为一种新的预后分子指标用于临床监测患者预后。如果能够对预测癌症进展的早期分子生物学事件进行确认，就可以更精确、更早期地对个性化病人进行危险性评估，从而更有利于诊断和治疗。Fhit蛋白表达减低与病人预后的关系以及FHIT基因能否作为判断乳腺癌预后的指标和在其他癌症诊治方面的价值尚有待于我们更深入的研究。
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10 Kitamura A，Yashima K，Okamoto，et al.Reduced FHIT expression ocˉcurs in the early stage of esophageal tumorigenesis:no correlation with p53expression and apoptosis.Oncology，2001，61（3）:205-211.
作者单位:255036山东省淄博市中心医院普外科（ Δ 病理科）
（收稿日期:2004-09-13） （编辑罗 彬）