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【摘要】 目的 探讨脆性组氨酸三联体（FHIT）基因与宫颈癌发病的关系。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应（nested RT-PCR)及DNA直接测序法对15例正常宫颈组织、30例宫颈癌组织及配对癌旁正常组织、宫颈癌Hela细胞系进行FHIT基因异常转录分析，并选择1例正常转录本及2例异常转录本进行DNA序列分析。结果 除7例宫颈癌组织及1例癌旁正常组织外，其余标本均扩增出FHIT基因野生型转录本。Hela细胞系同时存在野生型及异常转录本。FHIT基因的异常转录率在宫颈癌组织为47%（14/30），高于癌旁正常组织20%（6/30）及正常宫颈组织13%（2/15），差异均有显著性（P＜0.05)。FHIT基因的异常转录与癌组织的生物学特性无关。DNA测序证明异常转录本为FHIT基因多个外显子的缺失及DNA序列的插入。结论 FHIT基因的异常转录是宫颈癌组织及Hela细胞系中的常见事件，可能与宫颈癌的发生有关。
【关键词】 子宫颈肿瘤；基因脆性组氨酸三联体；逆转录聚合酶链反应；转录；遗传
Study on association of aberrant fragile histidine triad gene transcripts with human cervical cancer
LI Fu-qin,WANG Wei.
Department of Obstetrics and Gynecology,The 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the fragile histidine triad (FHIT) gene and human cervical cancer.Methods Normal cervical tissues from 15 patients,cancerous and matched adjacent normal tissues from 30 patients with cervical cancer and Hela cell line were examined for abnormalities of the FHIT gene transcripts by nested RT-PCR.1 normal and 2 abnormal samples were selected for DNA direct sequencing.Results Wild-type FHIT gene transcripts were found in all samples except 7 cancerous tissues and 1 adjacent normal tissues.There were wild-type and aberrant transcripts in Hela cell line.Abnormal FHIT gene transcripts were obtained from 47%(14/30) cancerous tissues,20%(6/30) matched adjacent normal tissues and 13%(2/15) normal tissues.The rate of aberrant FHIT transcripts in cancerous tissues was significantly higher than that in their matched adjacent normal tissues and normal tissues(P＜0.05).Clinicopathological analysis of patients showed that aberrant transcripts of the FHIT gene had no correlation with biological features of the tumors.Sequence analysis of the aberrant transcripts confirmed the absence of several exons of the FHIT gene and insertions of DNA sequences.Conclusion The expression of aberrant FHIT gene transcripts is common in cervical cancer and Hela cell line.Abnormalities of the FHIT gene may be associated with cervical tumorigenesis.
【Key words】 cervix neoplasms;genes FHIT;RT-PCR;transcription;genetic
3p染色体的杂合性缺失是宫颈癌中的常见事件，提示可能隐伏着与宫颈癌发生相关的抑癌基因。自1996年Ohta等［1］用外显子捕获法在3p14.2区克隆出脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad,FHIT)基因以来，已在多种恶性肿瘤细胞系及原发肿瘤中检测到该基因的异常，主要包括基因的纯合性缺失、杂合性缺失及异常转录。有关宫颈癌中FHIT基因的研究在国外虽日趋深入，但结果不尽相同，本研究采用巢式RT-PCR及PCR产物直接测序法检测了正常宫颈组织、宫颈癌组织及其配对癌旁正常组织、宫颈癌Hela细胞系中FHIT基因的表达，以期从转录水平阐明FHIT基因异常与宫颈癌发生及癌组织生物学特性的关系。
1 材料与方法
1.1 材料来源 收集2001年4～11月我院妇产科手术切除的30例宫颈癌标本及同一患者距癌组织最远处的癌旁正常组织各0.1～0.5cm3，取因良性肿瘤手术切除的正常宫颈组织15例作为对照，所有标本术后迅速置液氮内冷冻，然后贮存于-70℃深冻冰箱中。手术患者术前均未经过放疗、化疗。所有宫颈癌标本均经术后病理证实，其中鳞癌26例，腺癌4例；Ⅰ期12例，Ⅱ期18例；年龄27～62岁，平均46.5岁。宫颈癌Hela细胞均已妥善冻存。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 按照厂商介绍的方法，应用TRIzol试剂（GIBCO BRL公司）提取组织及细胞中总RNA，溶于无RNA酶的DEPC水中。取1μlRNA于DNA、RNA、蛋白浓度测定仪上测定其浓度及OD260/OD280值，选择此值>1.6的样品稀释至1μg/μl,-70℃冻存备用。
1.2.2 逆转录 取1μg总RNA，用Reverse Transcription System(Promega公司）试剂盒进行逆转录合成cDNA第一链，引物为Oligo(dT)15。
1.2.3 巢式PCR 以巢式PCR法扩增出FHIT基因Exon3～Exon10707bp的片段，引物序列参照文献［1］。外引物5U2：5’-ATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3,3D2:5-TCACTGGTTGAAGAATACAGGA-3;内引物5U1：5-TCCGTAGTGCTATCTACATC-3，3D1：5-CATGCTGATTCAGTTCCTCTTGG-3。以β-actin509bp长的片段作为内对照，引物序列为：P1:5-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3,P2:5-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3。第一轮PCR反应：20μl反应体系中含cDNA模板2μl,dNTP(10mM)1μl,MgCl2(25mM)1.5μl,FHIT基因外引物5U2、3D2或β-actin引物P1、P2（10mM)各2μl,Taq酶（5u/μl)0.3μl,10×Buffer 2μl。在PE Biosystems 9700型PCR仪上进行扩增，条件如下：95℃预变性5min，然后95℃30s、58℃30s、72℃30s共35个循环，72℃延伸10min。将第一轮PCR反应产物稀释20倍后取2μl作为模板，以内引物5U1、3D1按第一轮反应体系及条件进行第二轮PCR反应。同时设置以总RNA为模板进行巢式PCR反应的阴性对照。
1.2.4 产物检测 各取8μl第一轮及第二轮PCR反应产物上样于2%的琼脂糖凝胶（含EB）进行电泳，紫外灯下观察β-actin及FHIT基因两轮PCR产物条带，并摄影记录。
1.2.5 DNA测序 选择第二轮扩增宫颈癌旁正常组织中FHIT基因正常大小707bp转录本1例及宫颈癌组织中大小约250bp、350bp的异常转录本各1例，扩大反应体积至50μl重复PCR反应。取40μl PCR扩增产物进行2%低熔点琼脂糖凝胶（含EB）电泳，在紫外灯下观察并回收FHIT基因mRNA转录片段。应用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega公司）纯化回收扩增片段。应用上游引物5U1及荧光素标记的dNTP(PE公司测序试剂盒）扩增纯化后的cDNA,在ABI PRISM TM377自动测序仪中进行测序。
1.2.6 统计学方法 两样本率的比较采用四格表χ2检验或Fisher精确概率法进行统计分析。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
2.1.1 各标本电泳结果 所有标本cDNA经第一轮PCR扩增，电泳均可检测到β-actin509bp的完整条带，但均未检获FHIT基因扩增产物；经第二轮扩增后除7例癌组织及1例癌旁正常组织外，其余标本均检测到FHIT基因707bp野生型转录本。其中15例正常宫颈上皮组织中2例（13%）同时存在约250bp的异常转录本。Hela细胞系同时存在707bp及约300bp两种形式的转录本。见图1。在30例宫颈癌标本中，23例（77%）有FHIT基因707bp正常转录，其中7例同时存在1～2条短片段的异常转录，其余7例（23%）癌组织中并无正常大小转录本的扩增，包括1例转录缺失及6例不同大小的短片段异常转录。在异常转录中，以250bp及350bp片段较常见，且1例同时出现这两种异常转录。在30例癌旁正常组织中，只有1例（3%）未扩增出707bp片段而只有250bp小片段异常转录本，5例（17%）同时存在正常及异常转录本。以RNA为模板的阴性对照均未扩增出任何条带，见图2。
图1 － 图2 略
2.1.2 FHIT基因在正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌旁正常组织中转录情况的比较 见表1。FHIT基因的异常转录率在宫颈癌组织（47%，14/30）高于正常宫颈组织（13%，2/15），差异有显著性（P＜0.05)，同时高于癌旁正常组织（20%，6/30），差异有显著性（P＜0.05)。
2.1.3 FHIT基因异常转录与宫颈癌组织生物学特性的关系 见表2。ＦＨＩＴ基因的异常转录在宫颈癌临床分期、组织类型、分化程度、淋巴转移及肿瘤大小之间差异均无显著性（P＞0.05)。
表1 FHIT基因在正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌旁正常组织中转录情况的比较 略
表2 FHIT基因异常转录与宫颈癌组织生物学特性的关系 略
图3A 略
2.2 测序结果 选择1例癌旁正常宫颈组织约707bp的扩增产物进行测序，与Genebank FHIT 基因cDNA序列相比较，结果一致，证实有FHIT基因Exon3～Exon10的完整转录。选择宫颈癌组织异常转录本中大小约350bp、250bp的扩增产物进行测序，证实1例为331bp，Exon5～Exon8缺失，同时在Exon4和Exon9之间存在一段不明来源的98bp序列的插入（图3A），另1例为249bp，Exon4～Exon8部分缺失（图3B）。
图3B 略
3 讨论
现已公认肿瘤是一种基因型疾病，多种癌基因和抑癌基因的协同作用导致肿瘤的发生发展。研究发现常发生染色体缺失的部位可能有抑癌基因的存在，而脆性位点增加肿瘤形成中染色体缺失的可能性。故FHIT基因，作为第一个将脆性位点与肿瘤联系起来的候选抑癌基因，备受研究者们的关注。目前已发现该基因在多种实体瘤，如肺［1］、肾［2］、宫颈［3］、消化道［2］及头颈部肿瘤［4］中存在异常转录，表现为外显子的缺失及内源序列的插入，同时伴有DNA的缺失及FHIT蛋白的表达减少或缺失［3,5,6］。
FHIT基因位于3p14.2区，包含t（3；8）易位断裂点及脆性部位FRA3B。该基因全长1Mb，共10个外显子，其中Exon5～Exon9为开放性阅读框（ORF），编码16.8kD的蛋白质［2］，后者是一种Ap3A水解酶，能水解ApnA(n=3～6)生成ADP和AMP［7］。内含子4中存在HPV16整合位点，宫颈癌中HPV16整合在此位点可导致包括Exon5的大片段基因的缺失［8］。
宫颈组织中对于FHIT基因异常转录频率的分析，各试验所得结果不一致，在癌组织中为30%～80%，正常组织中为0～40%［3，9～14］。本实验采用巢式RT-PCT法，检测了15例正常宫颈组织，30例宫颈癌及其癌旁正常组织及宫颈癌Hela细胞系中FHIT基因的转录情况。结果显示，所有标本的cDNA均经第二轮PCR扩增方能检获FHIT基因扩增产物，表明在宫颈组织中FHIT基因普遍以低水平表达，这与其他学者在胃肠道肿瘤等其他肿瘤中得到的结果一致［15］。实验结果显示，FHIT基因的异常转录率在宫颈癌组织高于正常宫颈组织及癌旁正常组织，这与Su［11］、Yoshino［12］、Segawa［14］得到的结论相似，初步证明FHIT基因的异常转录与宫颈癌的发生密切相关。本实验中23%（7/30）的癌组织中只扩增出不同大小的异常转录片段，无野生型转录本存在，其中包括1例转录缺失，说明FHIT两等位基因均失活。
与其他实验者［11，12，14］得到的结论相似，笔者发现部分有FHIT异常转录的癌组织中同时含有正常转录本，这种现象可能因肿瘤组织混有正常细胞或肿瘤细胞存在异质性，即癌灶由不同的细胞克隆构成，其癌变是由于不同的基因改变方式所致。宫颈癌Hela细胞系中亦同时存在正常与异常转录本，这与Druck等［5］得到的结果相似，说明FHIT基因的改变并非完全是克隆性的。由此推测FHIT基因可能通过不同于经典抑癌基因的失活机制起作用，FHIT基因变异可能发生在单等位基因上，剩余的等位基因仍能转录野生型cDNA。
同时实验结果显示，13%（2/15）的正常细胞中也存在250bp的异常转录，许多学者在其他正常组织中亦得到相似结论［16，17］，并且发现衰老细胞中这种异常转录所占比例增加［18］，这一转录本同时在5例癌旁正常组织及3例癌组织中出现，推测正常情况下FRA3B脆性位点就有一定频率的断裂，它只反映了RNA断裂保守性的下降并非肿瘤特异性，如果此种损伤达到一定程度亦可能导致细胞癌变。本实验另一常见异常转录为331bp片段，由于此种异常转录仅在癌组织中及1例癌旁正常组织中出现，正常组织中并不存在，推测可能为肿瘤特异性的异常转录，与正常组织中的异常转录本相比由不同机制产生，与文献报道一致［11］。此例癌旁正常组织中的异常转录可能是由于部分已发生癌变的组织造成的。本实验2例异常转录均存在Exon5及Exon8的缺失，由于Exon5是编码功能蛋白质的第一外显子，而Exon8编码三原组氨酸功能区，故它们的缺失可导致FHIT基因功能蛋白质的产生缺如。按照Barnes等［7］的推测可能使FHIT蛋白抑制细胞增殖和（或）促进细胞凋亡的功能丧失，从而引起组织细胞异常增生而致使机体肿瘤的发生。Exon4的缺失提示在宫颈癌的发生中，FHIT非编码区可能发挥某种调控作用，从而影响FHIT基因表达和FHIT蛋白的功能。
本实验同时考察了FHIT异常转录与宫颈癌临床分期、病理类型、有无淋巴结转移及肿瘤大小的关系，证实FHIT异常转录与宫颈癌的生物学特性无关，与段晓明等［15］在大肠癌组织中研究FHIT异常转录得到的结论一致。
本实验通过巢式RT-PCR方法在转录水平证实了FHIT基因异常转录确与宫颈癌的发生密切相关，但与癌组织生物学特性无关，经DNA测序证实异常转录本涉及多个外显子的缺失，并且推测其中一种异常转录可能为肿瘤细胞特有的转录形式。虽然该基因可能并非通过经典抑癌基因的途径发挥作用，但越来越多的研究结果显示重建FHIT基因的表达能有效诱导凋亡及抑制宫颈癌细胞系在动物体内的成瘤性［19］。研究并阐明FHIT基因异常转录的确切机制、FHIT蛋白的功能以及对细胞增殖与凋亡的调节作用，可能为阐明包括宫颈癌在内的多种肿瘤的发生机制提供新的线索，为其早期诊断、预后及基因治疗提供理论依据。
【参考文献】
1 Ohta M,Inoue H,Cotticelli MG,et al.The FHIT gene,Spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma associated t(3;8) breakpoint,is abnormal in digestive tract cancers.Cell,1996,84:587-597.
2 Sozzi G， Veronese ML,Negrini M,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer.Cell,1996,85:17-26.
3 Greenspan DL,Connolly DC,Wu R,et al.Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors.Cancer Res,1997,57:4692-4698.
4 Virgilio L,Shuster M,Gollin SM,et al.FHIT alterations in head and neck squamous cell carcinomas.Proc Natl Acad Sci USA，1996,93:9770-9775.
5 Druck T,Hadaczek P,Fu TB,et al.Structure and expression of the human FHIT gene in normal and tumor cells.Cancer Res,1997,57:504-512.
6 Sozzi G,Tornielli S,Tagliabue E,et al.Absence of Fhit protein in primary lung tumors and cell lines with FHIT gene abnormalities.Cancer Res,1997,57:5207-5212.
7 Barnes LD,Garrison PN,Siprashvili Z,et al.Fhit,a putative tumor suppressor in humans,is a dinucleoside 5,5-p1,p3-triphosphate hydrolase.Biochemistry,1996,35:11529-11535.
8 Zimonjic DB,Druck T,Ohta M,et al.Positions of chromosome 3p14.2 fragile sites(FRA3B) within the FHIT gene.Cancer Res,1997,57:1166-1170.
9 Chu TY,Shen CY,Chiou YS,et al.HPV associated cervical cancers show frequent allelic loss at 3p14 but no apparent aberration of FHIT mRNA.Int J Cancer,1998,75:199-204.
10 Muller CY,OBoyle JD,Fong KM,et al.Abnormalities of fragile histidine triad genomic and complementary DNAs in cervical cancer:association with human papillomavirus type.J Natl Cancer Inst,1998,90:433-439.
11 Su TH,Wang JC,Tseng HH,et al.Analysis of FHIT transcripts in cervical and endometrial cancer.Int J Cancer，1998,76:216-222.
12 Yoshino K,Enomoto T,Nakamura T,et al.Aberrant FHIT transcripts in squamous cell carcinoma of the uterine cervix.Int J Cancer,1998,76:176-181.
13 Nakagawa S,Yoshikawa H,Kimura M,et al.Apossible involvement of aberrant expression of the FHIT gene in the carcinogenesis of squamous cell carcinoma of the uterine cervix.Br J Cancer,1999,79:589-594.
14 Segawa T,Sasagawa T,Yamazaki H,et al.Fragile histidine triad transcription abnormalities and human papillomavirus E6-E7 mRNA expression in the development of cervical carcinoma.Cancer,1999,85:2001-2010.
15 段晓明，张桂英,吴鄂生,等.胃肠肿瘤中FHIT基因的异常表达.湖南医科大学学报,2000,25:331-333.
16 Panagopoulos I,Thelin S,Mertens F,et al.Variable FHIT transcripts in nonneoplastic tissues.Genes Chromosome Cancer,1997,19:215-219.
17 Van Den Berg A,Draaijers TG,Kok K,et al.Normal FHIT transcripts in renal cell cancer and lung cancer derived cancer cell lines,including a cell line with a homozygous deletion in the FRA3B region.Genes Chromosomes Cancer,1997,19:220-227.
18 Gayther SA,Barski P,Batley SJ,et al.Aberrant splicing of the TSG101 and FHIT genes occurs frequently in multiple malignancies and in normal tissues and mimics alterations previously described in tumors.Oncogene,1997,15:2119-2126.
19 Roz L,Gramegna M,Lshii H,et al.Restoration of fragile histidine triad(FHIT)expression induces apoptosis and suppresses tumorigenicity in lung and cervical cancer cell lines.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:3615-3620.
作者单位： 150086 黑龙江哈尔滨,哈尔滨医科大学附属二院妇产科
(编辑：田 雨)