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【摘要】 目的 了解本区副溶血弧菌主要流行菌型和药敏情况，探讨PCR检测基因技术在鉴定中的应用。 方法 对经生化试验鉴定为副溶血弧菌的23株菌，以O-K血清进行分型，K-B法测试18种抗生素的敏感性，采用PCR方法检测特异基因（toxR）和毒力基因（tdh、trh）。 结果 3株副溶血弧菌中O 3 :K 6 型占21株，O 10 :K 28 和O 1 :K 1 各1株，toxR基因均阳性，对氟哌酸等较敏感。其中20株菌tdh基因阳性，且均为O 3 :K 6 型，与小白鼠致死结果符合。 结论 表明本区流行的副溶血弧菌以有较强毒力的O 3 :K 6 型为主。
【关键词】 副溶血弧菌 血清分型 基因检测
副溶血弧菌广泛存在于海水和海产品中，是夏秋季引起细菌性食物中毒和急性腹泻的主要病原菌，目前已占了很大的比例。该菌引起的急性肠胃炎来势凶猛，尤其对儿童、年老体弱者危害更大，因此在食品安全和食物中毒调查中被列为必检项目。自1950年日本人在大阪发生的一起沙丁鱼食物中毒样品中首次分离到该菌后，有关中毒报告和生物学特性研究几十年来经久不衰。近几年副溶血弧菌的研究重点则集中在抗原分析、毒力基因（tdh、trh）和特异性基因（toxR、pR72H）检测方面，并已初步建立了相应的检测方法。但是国内大多实验室限于条件，对该菌的鉴定仍停留在做生化反应和嗜盐性试验上，未能很好开展细菌毒力和细菌分型等试验。我们为了了解本区副溶血弧菌的流行情况和探讨PCR技术在鉴定工作中的应用，对2004年收集到的23株副溶血弧菌除按国家标准进行生化反应、嗜盐性试验、小鼠毒力试验外，利用日本国立卫生研究院提供的OK血清作分型，并且首次开展副溶血弧菌两类基因检测，同时还观察了溶血和药敏试验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 23株副溶血弧菌 均是我实验室从2004年本区食源性疾病病人粪便和环境样品中分离到。
1.1.2 培养基 3.5%氯化钠结晶紫胨水、TCBS、嗜盐性选择琼脂、MH琼脂、3.5%氯化钠TSI均由上海疾控中心提供，血琼脂、各生化反应管、不同浓度氯化钠胨水、LB琼脂、26种抗生素药敏纸片均由杭州市微生物试剂厂提供，效期内使用。
1.1.3 OK血清 由日本国立卫生研究院提供，批号:5931212004年12月前有效。
1.1.4 引物 tdh的引物（5'-CCACTACCACTCTCATATGC-3';5'-GGTACTAAATGGCTGTCATC-3'），trh的引物（5'-GGCTCAAAATGGTTAAG CG-3';5'-CAT TTCCGCTCT-CATATGC-3'），toxR引物（GTCTTCTGACGCAATCGTTG;AT-ACGAGTGGTTGCGGTCATG），Taq酶、MgCl 2 、dNTPs等均购自海生物工程有限公司。
1.1.5 实验动物 雄性小白鼠，每只体重15±2g，由浙江医学科学院动物房提供。
1.2 方法
1.2.1 增菌、分离、生化反应、嗜盐性试验、小白鼠毒力试 验按国家标准GB/T4789.7-2003进行操作。
1.2.2 抗生素敏感试验 采用WHO推荐的K-B法，本次实验仅对常用的18种抗生素进测定。
1.2.3 血清分型 菌种分纯后接种LB琼脂，36℃16～18h后取菌苔以玻菌片法作K抗原分型，然后刮取菌苔以灭N.S制成细菌混悬液，121℃、30min去K抗原，4000r/min离心10min，弃去上清液，再以玻片法作O抗原分群。
1.2.4 副溶血弧菌基因检测 PCR反应体积为25μl，含1×buffer、MgCl 2 1.5mmol/L、dNTPs0.2mmol/L、一对引物各1μmol/L、Taq酶25U/ml及1μl模板DNA。模板DNA制备:将菌株营养肉汤24h培养物10000rpm离心5min，弃去上清，加入100μl双蒸水，100℃水浴10min，再14000rpm离心10min，取上清即为模板DNA。反应程序为:94℃3min预变性DNA后，按94℃30s，58℃45s，72℃45s，进行35个循环，最后一个循环结束后，72℃延伸5min;用含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯下照相记录结果。tdh扩增产物预期长度为251bp，trh扩增产物预期长度为250bp，toxR扩增产物预期长度为350bp。PCR阳性参考株为副溶血弧菌WP1号菌株（tdh+）、AQ4037号菌株（trh1+）和AT4号菌株（trh2+），阴性参考株为溶藻弧菌2株。
2 结果
2.1 培养基上的生长情况 23株副溶血弧菌在TCBS上生长良好，表现为不分解蔗糖的蓝绿色、圆型、中等偏大菌落;在嗜盐性选择琼脂上生长茂盛，呈扩散趋势;血琼脂上表现为灰白、溶血菌落。
2.2 生化和耐盐试验结果 与国家标准GB/T4789.7-2003相符（见表1）。
2.3 抗生素敏感试验 本次药敏试验选用氟嗪酸、氟哌酸等18种常用抗生素按K-B法测试，测试结果以平均抑菌直径报告，大致分为3类:（1）较敏感:菌必治（26±3mm）、氟哌酸（25±3mm）、先锋必（24.5±2.5mm）、氯霉素（24.5±2.5mm）、氟嗪酸（24±3.5mm）、四环素（22±2mm）复方新诺明（21.7±4mm）;（2）中等敏感:头孢噻肟（18±2mm）、红霉素（18±2.5mm）、庆大霉素（17.5±1.5mm）、卡那霉素（17.5±1.5mm）、呋喃妥因（16.5±2mm）、先锋V（16±3mm）;（3）耐药（小于8mm）:青霉素G、氨卞青霉素、万古霉素、林可霉素。
2.4 小白鼠毒力试验 20只小白鼠腹腔接种0.3ml/只培养物（其中1只阴性对照），1h后开始观察，以24h为限。发现1.5h左右即出现竖毛、行动迟缓、集聚等表现。5h后第1只死亡，10h共死亡16只，4只未死亡（含阴性对照），结果见表2。
2.5 副溶血弧菌基因检测结果 23株副溶血弧菌全部检出toxR基因;tdh基因阳性的有20株，均是O 3 :K 6 型;trh基因阳性仅2株，分别是O 10 :K 28 和O 1 :K 1 型。对照的2株溶藻性弧菌3种基因均阴性。结果见表2。
表1 23株副溶血弧菌生化和耐盐试验结果（略）
表2 23株副溶血弧菌血清型和基因检测、毒力试验情况（略）注:（+/t）中+表示阳性，t表示参试菌株数
3 讨论
（1）副溶血弧菌现分出13个O抗原，67个K抗原，菌型较复杂，并且和其他弧菌有交叉，血清分型难度较大。国内郝士海等在20世纪60～70年代进行过一些研究，以后上海市防疫站也做过相关工作，但最终没能提供商品化的试剂，使大多实验室无法开展血清分型工作，流行调查工作缺少了实验室依据。这次我们采用日本国立卫生研究院提供的OK血清，和杭州市疾控中心合作，血清分型工作较顺利，23株副溶血弧菌全部分型，其中O 3 :K 6 型21株，O 10 :K 28 型和O 1 :K 1 型各1株。O 3 :K 6 型占91%以上，与浙江省疾控中心去年全省副溶血弧菌菌型调查结果相吻合 ［1］ 。（2）副溶血弧菌菌型较多，而来自海水或海产品的很大一部分菌株毒力弱，并不致病，所以对环境中分离到的菌株必须进行毒力试验。一般以KP溶血试验和小鼠毒力试验作为依据。但现已证明某些KP阴性株带肠毒素样活性物质，可引起腹泻，部分溶藻性弧菌也可使小鼠致死。因此确定毒力强弱比较可靠的是直接测定TDH、TRH毒素或检测tdh、trh毒力结构基因。从这次小鼠致死试验和tdh、trh基因检测情况看，tdh阳性株均具有较强的毒力。（3）toxR基因被认为是副溶血弧菌种水平上的一特异性基因，应用PCR技术检测toxR基因是鉴定副溶血弧菌的一种新手段。我们这次实验中，对经生化试验鉴定为副溶血弧菌的23株菌，检测toxR基因，结果见表2，符合率100%，同时作为对照的2株溶藻性弧菌均阴性。toxR基因检测虽然特异性高，出结果也快，但目前成本和实验条件是推广应用的主要制约因素。（4）本次药敏试验显示抗革兰阴性菌药物菌必治、氟哌酸、氟嗪酸等效果较好，而青霉素类不太敏感，与北京李长青报告的结果一致 ［2］ ，且与广东的一株海产品分离株有很大差别 ［3］ ，因此选用合适抗生素应因菌株而异。
参考文献
1 程苏云，梅玲玲，任锦玉.食源性病原菌.浙江疾病预防控制，2004，4:14-15.
2 李长青，吴明水.患者大便与可疑食品同时检出副溶血弧菌的报告.中国卫生检验杂志，2000，6:744-745.
3 刘强，王侃.斑节对虾红体病细菌性病原的初步研究.粤海通讯，2000，2，26.
（编辑若 木）
作者单位:311201浙江省杭州市萧山区疾病预防控制中心