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【摘要】 目的 了解产CTX-M-1型ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在临床的分布情况。 方法 应用美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的表型确证试验，筛选出不重复的产ESBLs菌株168株，其中大肠埃希菌148株，肺炎克雷伯菌20株，采用聚合酶链反应（PCR）技术检测CTX-M-1组基因型。 结果 产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，CTX-M-1型阳性率为分别为53.4%（79/148）和20.0%（4/20）。 结论 产ESBLs的大肠埃希菌多数为CTX-M-1组型，而在产ESBLs肺炎克雷伯菌中不是主要基因型。结果提示有相当一部分引起感染菌株的耐药性是由CTX-M-1组酶引起，并增加了临床抗感染治疗的难度。
【关键词】 超广谱β-内酰胺酶;CTX-M;大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌;聚合酶链反应
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）又称氧亚氨β-内酰胺酶，是指细菌质粒介导的能水解甲氧亚氨基β-内酰胺类抗生素（oxyimino-β-lactams），如头孢他啶、头孢噻肟以及氨曲南等β-内酰胺酶，由于ESBLs能水解青霉素类、头孢菌素及单环类抗生素，作用底物广泛而称之 ［1］ 。ESBLs种类最多的是TEM、SHV和CTX-M族。TEM是大肠埃希菌最常见的β-内酰胺酶。SHV是肺炎克雷伯菌最常见的β-内酰胺酶。近年来，一个新的质粒介导的ESBLs家族CTX-M的数量也在不断增加。CTX-M型酶以对头孢他啶、头孢噻肟高水平耐药为主要表型特征。为此，本文对昆明市第一人民医院168株产ESBLs临床分离株进行了CTX-M-1组基因检测，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 2002年1月～2004年6月昆明市第一人民医院细菌室从临床感染病人的痰、尿、血液等标本中分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共435株，筛选出不重复产ES-BLs菌168株，其中大肠埃希菌148株，肺炎克雷伯菌20株。均按照《全国临床检验操作规程》第2版常规培养分离。菌株采用BD BBL Crystal ENF鉴定系统鉴定。
1.2 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型的初筛与确证 法国梅里埃公司Mueller-Hinton琼脂、英国OXOID生产的药敏纸片，广东乐通泰公司提供。在一个MH平板上同时采用NCCLs推荐的纸片扩散法初筛试验、双纸片确证试验和双纸片协同试验三种方法。用药敏纸片分配器同时贴上初筛试验的头孢噻肟（CTX）、头孢曲松（CRO）、头孢他啶（CAZ）、氨曲南（ATM）、头孢他啶/棒酸（CD02，30μg/10μg/片）和头孢噻肟/棒酸（CD03，30μg/10μg/片），中央贴阿莫西林/棒酸（AMC）。初筛试验、双纸片确证试验结果判读依照NCCLs文件标准。双纸片协同试验的结果判定 ［2］ :以上CTX、CRO、CAZ、ATM任一纸片与AMC之间出现齿孔状或协同抑菌斑为ESBLs阳性。以双纸片确证试验和协同试验同时阳性确定为ESBLs。以大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212、产酶型大肠埃希菌ATCC35218作为质控菌株跟随实验，所有质控结果均在控制范围内。
1.3 主要仪器 核酸蛋白检测仪:eppendorf公司Biophot-meter型，PCR扩增仪:personal cycler，Biometra型。电泳仪BIO-RAD公司powerPAC3000型。凝胶成像系统:BIO-RAD公司Gel Doc2000型。
1.4 菌株质粒DNA的提取及PCR扩增
1.4.1 采用传统碱裂解法提取细菌质粒 ［3］ 参照文献 ［4］ 设计引物CTX-M-1组（包括CTX-M-1、3、10、11、12），扩增片段217bp。F:5′-ACAGCGATAACGTGGCGATG-3′R:5′-TCGCCCAATGCTTTACCCAG-3′。
1.4.2 反应体系 总体积25μl。含10×buffer2.5μl、Mg 2+ 1.5mM2.5μl、dNTPs200uM1.0ul、Taq酶1.0u、Primer50pmol0.5μl、DW14.5μl、DNAtemplate5.0μl，均为上海博亚生物技术有限公司产品。
1.4.3 PCR扩增 94℃预变性3min，变性94℃45s、退火56℃45s，延伸72℃45s，最后72℃延伸5min。共循环32次。1.4.4 扩增产物的处理 用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，用凝胶成像系统观察结果并照像。每组PCR均设阳性及阴性对照，阴性对照株为大肠埃希菌ATCC25922和蒸馏水。阳性对照株为产酶型大肠埃希菌ATCC35218。
1.5 数据分析 采用WHONET5.0软件进行分析。产CTX-M-1组型ESBLs检出率的比较用χ 2 检验。
2 结果
2.1 产ESBLs株CTX-M-1组基因阳性率 见表1。 表1 产ESBLs株CTX-M-1组基因阳性率菌名 菌株总数 阳性菌株 阳性率（略）注:经χ 2 检验显示，该基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的分布差异性有显著性
2.2 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各种标本中的分布 见表2。产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各类标本的分布有较大差别。大肠埃希菌主要来源于临床送检的尿和痰标本。肺炎克雷伯菌主要来源于痰标本。表2 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各种标本中的分布（略）
2.3 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各科室的分布特点 产酶菌株广泛分布于多个临床科室，其中分离率最高的科室为ICU和神经外科，分别占16.46%和15.19%，其次为 干疗科占12.66%。见表3。表3 产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各科室的分布特点 株（略）
2.4 产CTX-M-1组型ESBLs菌株的耐药状况 见表4。 表4 产ESBLs大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌药敏试验结果（略）
3 讨论
早在1986年，日本Matsumoto等在一次动物实验中，从狗的粪便中分离出1株耐头孢噻肟的大肠埃希菌，并发现其产一种非TEM、非SHV的ESBLs，命名为FEC-1。1989年初，德国的Bauernfeind等报道了1株耐头孢噻肟的大肠临床分离株，能产非TEM、非SHV的ESBLs，因其耐头孢噻肟而命名为CTX-M-1 ［5］ 。之后，CTX-M型ESBLs在世界各地不断被发现，在全球各地区和众多的临床菌种中，特别是肠杆菌科细菌中，形成了一个快速增长的ESBLs家族。至目前CTX-M家族已近40种酶。研究资料显示，CTX-M型ESBLs产酶株的菌谱及地域分布极为广泛，是导致某些地区ESBLs产酶株传播或流行的主要基因型。我国医院感染ESBLs产酶株的分子流行病学研究表明，CTX-M型酶是最为常见的基因型，甚至某些地区CTX-M-1组型ESBLs的检出率已经超过TEM和SHV型ESBLs。国内北京流行CTX-M-14、22、24、SHV-2、12 ［6］ 。上海以CTX-M-3为主 ［7］ ，浙江以CTX-M-22、24为主 ［8］ ，广州发现CTX-M-9、13、14 ［9］ 。我们的研究结果显示，临床分离菌株中的ESBLs大部分属于CTX-M-1组型，其中CTX-M-1组基因型在产ESBLs大肠埃希菌中阳性率较高，产ESBLs肺炎克雷伯菌中CTX-M-1组基因型是次要的，结果类似于国内一些相关的报道 ［10］ 。结合CTX-M-1组基因携带率，推测本地大肠埃希菌中的ESBLs可能以CTX-M型为主。昆明以何种CTX-M亚型为主，有待于进一步深入研究。可见，临床感染的大肠埃希菌中有相当一部分分离株的耐药性由CTX-M型酶引起，大大增加了临床抗感染治疗的难度。因此，建议临床医生按照ESBLs的检测结果及NC-CLS指南选择使用抗生素来确定有效的治疗方案。
CTX-M酶对窄谱头孢菌素水解活性最高，而水解青霉素类的活性不及TEM和SHV。该类酶对头孢噻肟的耐药程度远远高于头孢他啶，通常情况下对头孢噻肟的耐药高于头孢他啶至少35倍 ［11］ 。对头孢他啶酶活性弱是多数CTX-M酶区别于TEM、SHV头孢菌素酶的标志。此外，CTX-M酶表现出对头孢吡肟、头孢匹罗高度的水解活性，对7-a-甲氧基头孢菌素类（头孢西丁）和碳青酶烯类（亚胺培南、美罗培南）无水解活性。按照欧洲和NCCLS指南，一些产CTX-M酶菌在体外对头孢他啶敏感而在体内耐药。用头孢他啶治疗产CTX-M酶菌引起的感染常会导致治疗失败，并增加CTX-M酶的产生 ［12］ 。本研究中药敏表型结果显示大肠埃希菌对头孢噻肟的耐药率高达83.8%，而对头孢他啶的耐药率仅为10.1%，这可能是临床大量使用头孢噻肟等抗生素而促成产CTX-M型ESBL耐药株出现的重要原因之一。笔者认为产ESBLs的耐药问题，已成为临床上较为普遍、必须予以高度重视的问题。建议临床医生:（1）临床抗感染治疗中，首先应提高病原微生物送检率，加强ESBLs等耐药细菌的监测;（2）应根据药敏结果，选用合理抗生素，不要盲目进行经验性性治疗;（3）ICU、神经外科等ESBLs发生率较高的病房，可暂停使用β-内酰胺类抗生素，以减少此类抗生素所致的选择性压力，改用β-内酰胺抗生素/β-内酰胺酶抑制剂、头霉素（如头孢替坦）、碳青霉烯类（如亚胺培南）等其它抗生素。 本文结果还显示产CTX-M-1组型ESBLs菌株在各类标本的分布有较大差别。大肠埃希菌主要来源于临床送检的尿和痰标本，肺炎克雷伯菌主要来源于痰标本。这可能是菌种对不同体液的选择性分布有关。另外，结果还显示:产酶大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌主要分布于ICU、神经科、干疗科、呼吸科等。这些结果与国内报道较接近 ［12］ 。其可能与科室存在不同程度感染及控制措施的疏漏，由此引起产ESBLs菌株的传播有关。因此，可以认为产酶耐药菌成为优势菌而引起机体的感染，一方面与患者病情危重、机体抵抗力下降、免疫功能低下、接受侵袭性操作（如气管切开、插管等）有关，另一方面与大剂量、长时间广谱抗生素的使用分不开。所以，通过对产ESBLs大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌基因型检测，对查清临床流行状况、预防产ESBLs菌株在临床广泛传播、有效治疗其引起的严重感染性疾病、医院感染控制、指导临床正确合理使用抗生素等多方面具有十分重要意义。
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* 基金项目:昆明市科技局2002年重点科技计划项目（编号:昆科社字2002-01-18）
作者单位:650011云南昆明，昆明市第一人民医院
（编辑:若 木）