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【摘要】 目的 为评估锝标记抗D-二聚体单抗在兔早期股动脉血栓定位诊断中的应用。方法 将 99m Tc标记的抗D-二聚体单抗4D30注入兔体内，进行放射免疫显像。分别观察血栓部位和对侧相应部位的放射性分布，计算放射性比值;显像完毕后取血栓及周围肌肉组织，称重后测定单位质量的放射性计数及比值;取心、肝、脾、肺、肾及膀胱组织，观察病理学改变。结果 股动脉血栓形成6h内，注入显像剂后30min，血栓开始显像。血栓/血液和血栓/周围肌肉单位质量放射性比值分别为2.08±0.33，3.68±0.74。各器官均未见明显病理学改变。结论 提示 99m Tc-4D30可以用于实验性早期动脉血栓的定位诊断。
关键词 锝 单克隆抗体 D-二聚体 血栓
99m Tc labeled anti-D-dimer monoclonal antibody for the diagnosis of early femoral arterial thrombus of rabbit
Liu Yu，Dong Xiaoli，Wang Jue，et al.
Department of Pathology，Capital University of Medical Science，Beijing100054.
【Abstract】 Objective To evaluate the uslefulness of technetium（ 99m Tc）labelled monoclonal anti-D-dimer antibody（4D30）for target diagnosis of early femoral arterial thrombus of rabbit.Methods Radioimaging and quantitative radioactive analysis were performed by SPECT after 99m Tc-4D30was injected.Results Thrombus-to-blood and thrombus-to-muscle ratios were counted with gamma counter.The morphologic changes in heart，liver，spleen，lung，kidney and bladder were observed under light microscope.The femoral arterial thrombi showed at30min after injection（6h after the thrombi formed）.Thrombus-to-blood and thrombus-to-muscle ratios were2.08±0.33and3.68±0.74.No pathologic change in all organs was observed under lightmicroscope.Conclusion It is concluded that the 99m Tc-laˉbelled anti-D-dimer monoclonal antibody（4D30）can be regarded as one of potential target agent in diagnosis of early femoral arterial thrombus.
Key words technetium monoclonal antibody D-dimer thrombus
血栓性疾病的早期正确诊断对及时治疗和改善预后有重要价值，但目前仍是急待解决的临床难题。常规的诊断方法如静脉造影为有创性检查，且造影剂有很多副作用，包括恶心、呕吐、皮肤潮红、肾脏毒性和心脏毒性等 ［1，2］ ;多普勒超声对诊断小腿和腹股沟韧带上方的深静脉血栓不够敏感，对主干阻塞但有较粗侧支循环代偿的深静脉血栓常难以诊断等 ［3，4］ ;近年来，国际上已出现抗血小板和抗纤维蛋白抗体的血栓放射免疫显像研究，显示了较好的应用前景 ［5］ 。本实验将抗D-二聚体单抗标记上锝（ 99m Tc），注入兔体内，对兔实验性股动脉血栓行放射 ˇ免疫显像，以评估其在血栓定位诊断中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 西兰大白兔32只，雌雄不限，体重2.5～3.0kg，购于首都医科大学实验动物中心。按抽签法随机分为3组。股动脉血栓组（16只），分为24h血栓组（8只）和30h血栓组（8只）;股动脉钳夹组（8只）;正常组（8只）。
1.2 血栓模型的制备 20%氨基甲酸乙酯（5ml/kg）经耳缘静脉注入，麻醉生效后，将兔仰卧固定，沿右侧股动脉走行切开皮肤及皮下组织，钝性分离右侧股动脉，选择直径约1mm，长约1.5cm的血管段为手术部位，用微型血管夹夹住上下两端，将磨钝的5号针头刺入血管内，用针腹反复轻轻搔刮血管内膜，搔刮面积尽可能大些。拔出针头后用医用无损伤缝合针缝合刺破孔，待刺破孔不渗血时，触摸家兔膝内侧皮下支动脉搏动示血管已通畅。然后逐层缝合，关闭皮肤切口，并盖以无菌纱布 ［6，7］ 。
1.3 放射免疫显像 鼠抗人D-dimer单抗4D30（德国BIOTRENB公司生产）以亚锡还原法与 99m Tc（北京森科公司生产）进行标记，并用纸层析法检测其标记率 ［8］ 。 股动脉血栓组分别于造模术后24h和30h经兔耳缘静脉注射 99m Tc-4D30（单抗的剂量为20μg/kg， 99m Tc的比活度为14.8MBq/kg），于注射后5、10、30min，用SPECT仪行兔腹股沟部前后位平面显像，每帧计数1×10 7 ，采集矩阵为128×128。股动脉钳夹组于钳夹股静脉30min后，分别于注射后5、10、30min，用SPECT仪行兔腹股沟部前后位平面显像。正常组分别于注射后5、10、30min，用SPECT仪行兔腹股沟部前后位平面显像。
1.4 显像图的定量分析 股动脉血栓组活体显像结束后，从各时相显像图上勾画出血栓部位和对侧相应部位的等面积感兴趣区（ROI），测量各部位的放射性计数，计算血栓部位与对侧相应部位的ROI计数比值;股动脉钳夹组活体显像结束后，从各时相显像图上勾画出钳夹部位和对侧相应部位等面积感兴趣区（ROI），计算ROI计数比值;正常组活体显像结束后，从各时相显像图上勾画出相应于血栓部位和对侧相应部位等面积感兴趣区（ROI），计算ROI计数比值。
1.5 血栓/全血（T/B）和血栓/周围肌肉组织（T/M）比值测定 股动脉血栓组活体显像结束后，切取等长度的股动脉血栓血管和对侧股动脉血管（保留管腔内血液）及周围肌肉组织，称重后，分别放入试管中用γ计数器进行γ计数，计算T/B比值和T/M比值。T/B比值=单位质量血栓的放射性计数（cpm/g）/单位质量全血的放射性计数（cpm/g） T/M比值=单位质量血栓的放射性计数（cpm/g）/单位质量肌肉的放射性计数（cpm/g）
1.6 形态学观察 γ计数检测完毕后，将股动脉血栓处血管和心、肝、脾、肺、肾及膀胱组织放入10%福尔马林液固定。采用石蜡切片法制备组织学切片，常规HE染色，利用光学显微镜观察组织学改变。
2 结果
2.1 99m Tc标记抗D-二聚体单克隆抗体4D30的标 记率 用纸层析检测 99m Tc与抗D-二聚体单克隆 抗体4D30的标记率为85%～90%，显示此血栓显像剂可用于放射免疫显像及其检测。
2.2 形态学观察结果 股动脉血栓造模术后24h，股动脉管腔内均未见血栓形成;股动脉血栓造模术后30h，股动脉管腔内均可见呈粉染半透明分枝状的血小板小梁和网状排列的纤维素，纤维素网眼中可见红细胞等混合血栓成分。心、肝、脾、肺、肾及膀胱组织均未见明显病理学改变。
2.3 放射免疫显像结果 活体显像图定量分析结果表明，注明 99m Tc-4D30后5min、10min、30min、30h血栓组股动脉血栓局部放射性聚积逐渐增多，30min时血栓开始显像（见图1，表1）;而股动脉钳夹组及正常组右侧股动脉放射性聚积未见增多。图1 股动脉血栓组、股动脉钳夹组和正常组对照（箭头指向血栓部位）
2.4 T/B比值和T/M比值测定结果 股动脉血栓组:T/B=2.08±0.33，T/M=3.68±0.74。
表1 股动脉血栓组、股动脉钳夹组及正常组ROI比值 （略）
3 讨论
血栓性疾病理想的诊断方法应是安全、准确和无创的，可同时提供解剖和功能信息。放射性核素显像的最大优势是可以无创性检测血管的功能状况。近年来，应用单克隆抗体和肽类制备血栓显像剂，为血栓定位显像的实验研究和临床应用提供了更特异、更敏感和更快速的方法。目前用于血栓检测的放射性药物主要包括4类:（1）抗血小板单抗;（2）抗纤维蛋白单抗或单抗片段;（3）抗纤溶酶原激活剂抗体;（4）肽类药物。其中研究最多的显像剂为抗血小板抗体显像剂和抗纤维蛋白单抗或单抗片段显像剂。血小板和纤维蛋白是构成血栓的主要成分 ［9］ ，D-二聚集（D-dimer，DD）只存在于交联纤维蛋白及其降解产物中，不存在于纤维蛋白原及纤维蛋白单体中 ［10，11］ ，因此，以放射性核素标记标D-二聚体单克隆抗体作为示踪剂，理论上可用于血栓的放射免疫显像。 Knight等应用 111 n标记抗纤维蛋白β链氨基端位点单抗59D8-Fab检测实验性狗股静脉血栓，于血栓形成后24h，静脉注射 111 In-59D8-Fab后24h，8只狗中的6只显像，其中3只在注射后3～4h即显像，24h T/B比值约为7.1±1.3 ［12］ 。Ruan等用 99m Tc标记抗D-二聚体单抗SZ-63，对实验性狗股动脉血栓进行了放射免疫显像研究。结果表明:注射 99m Tc-SZ-63后2.5h血栓显像开始清晰，8h T/B比值和T/M比值分别为2.56±0.83和13.40±5.10 ［13］ 。
本实验用机械法损伤兔股静脉内膜，术后24h股静脉管腔内均未见血栓形成，术后30h股静脉管腔内均可见血栓形成，因此可以推断术后30h为血栓形成6h内，且模型制备重复性、可靠性较好，血栓形成的部位较为恒定，因而可以用来研究早期股静脉血栓的定位诊断。
本实验于注射 99m c-4D30后30min，8只兔股动脉血栓均开始显像，30min时股动脉血栓组的T/B比值为2.08±0.33，T/M比值为3.68±0.74。由于随着时间延长，血栓显像剂在血栓局部聚集增多，T/B比值和T/M比值逐渐增大。本实验显像时间较早，因而与Knight等人的实验结果相比，T/B比值和T/M比值相对较小。
股动脉钳夹组及正常组右侧股动脉放射性聚积随时间延长未见增多。此结果表明:局部放射性核 素的异常聚积，与单纯动脉血液循环障碍及正常血 液循环无关，而取决于局部是否有凝血过程发生。HE染色结果显示各主要器官均未见明显病理改变，说明此血栓显像剂安全性较好。
因此， 99m Tc-4D30可以作为一种血栓示踪剂，用于实验性早期动脉血栓的定位诊断，至于其在临床血栓性疾病诊断中的应用价值，尚有待于进一步的探讨和研究。
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（收稿日期:2004-06-30）
作者单位:1100054北京首都医科大学病理学教研室
首都医科大学宣武医院
基金项目:北京市教委基金资助项目（编号:01KJ-094）（编辑李 木）