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【摘要】 目的 探讨再生障碍性贫血（AA）患者的骨髓间充质干细胞（MSCs）体外对T淋巴细胞的免疫调节作用。方法 分离和体外培养骨髓间充质干细胞，与植物血凝素刺激的T细胞共培养，流式细胞仪检测T细胞的表面活化标志，MTT法检测T细胞受抑情况。结果 AA患者骨髓MSCs在细胞形态和免疫表型上与缺铁性贫血患者没有明显差异，但对活化T细胞的免疫抑制作用明显减弱，而且SAA与CAA患者的骨髓MSCs之间也存在明显差异。结论 AA患者骨髓MSCs对T细胞的免疫抑制作用减弱。
【关键词】 贫血 再生障碍性 间充质干细胞 免疫
Research on role of mesenchymal stem cells in aplastic anemia
LING Yun，CAO Xiang-shan，ZHANG Chuan-qing，et al.The First People’s Hospital of Changzhou，Changzhou 213003，China
［Abstract］ Objective To investigate the immune regulatory effects of bone marrow mesenchymal stem cells of patients with aplastic anemia in vitro.Methods MSCs were isolated and cultivated from human bone marrow cells，and identified with cell morphology，and the phenotypes were assessed by flow cytometry.Mononuclear cells from peripheral blood were stimulated with PHA and incubated with or without MSCs.T cells proliferation was assessed by MTT method，and activities markers were observed before and after co-cultured with MSCs.Results The abnormalities of MSCs included:1）significant lower suppression of T-cell proliferation induced by PHA;2）impaired ability to suppress CD38 expression on PHA-primed T cells;3）impaired capacity to suppress IFN-γ production in PHA cultures.Conclusion The ability of MSCs to down regulate priming，proliferation，and cytokine release of T-cell is deficient in patients with AA.
［Key words］ aplastic anemia;mesenchymal stem cells;immunity
再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是血液系统常见的疾病，发病原因十分复杂，目前认为与造血干细胞内在增殖缺陷、造血微环境功能缺陷及机体免疫功能紊乱有关［1］。造血微环境主要由骨髓基质细胞组成，以往对造血微环境的研究多停留在基质成分的基础上。随着实验技术的不断提高，人们已经能够从骨髓中分离得到间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。骨髓MSCs是从骨髓中分离得到的非造血干细胞，易于分离培养，扩增和纯化，多代培养后仍具有干细胞的特性［2］。在体外实验和动物模型中证实了MSCs还具有较强的免疫调节作用［3］，尤其是作用于T淋巴细胞，与造血干细胞共移植，可以抑制GVHD的发生，有助于造血和免疫功能重建［4］。在对接受高剂量化疗的乳腺癌患者的研究中发现，输注自身体外扩增的MSCs可以促进血小板的恢复［5］。有学者认为［4］，MSCs对T细胞的抑制作用关键在于MSCs骨髓原位抑制了T细胞的活化。为了了解AA患者的MSCs是否存在缺陷，笔者从AA患者和缺铁性贫血患者的骨髓中分离、培养和扩增MSCs，比较两者来源的MSCs表面标志表达和对不同刺激条件下T细胞活化的免疫调节作用。期望为AA发病机制的进一步研究提供理论基础，并为临床应用MSCs提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 所有患者均来自常州市第一人民医院门诊及血液科住院患者。17例AA患者均符合1987年第四届全国再障会议修订的诊断标准［6］，其中重型AA（SAA）5例，慢性AA（CAA）12例，男10例，女7例，年龄17～55岁，平均29.5岁；均接受过免疫抑制治疗，13例正接受免疫抑制治疗，其中8例为复发，4例处于缓解期。对照组为缺铁性贫血患者5例，其中男2例，女3例；年龄22～49岁，平均31.5岁。
1.2 仪器与试剂 Ficol-l-hypaque细胞分离液（上海试剂二厂），胎牛血清（FBS）、L-DMEM和RPMI1640培养基（GIBCO公司），胰蛋白酶（SIGMA公司），FITC或PE标记的鼠抗人CD27、CD69、CD45RO、CD38、CD44、CD34、CD45、CD71、CD117、CD13、CD25、HLA-DR、CD29等单抗以及同型对照IgG1/IgG2（BD公司），植物血凝素（PHA），流式细胞仪（BD公司）。
1.3 方法
1.3.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养 抽取AA患者骨髓液5ml，肝素抗凝，经等体积的L-DMEM培养液稀释后缓慢加入1.077 g/L的Ficoll细胞分离液，800 rpm离心20 min，分离得到单个核细胞，2%FBS的L-DMEM液洗涤2次，按2×105/ml密度接种于25 cm2培养瓶，培养液为含10%FBS的L-DMEM，每瓶5 ml，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。72 h后全量换液，去除非贴壁细胞，以后每隔3～4天换液1次，待细胞融合90%时，用0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养。按同样方法获取缺铁性贫血患者的MSCs，作为对照组。
1.3.2 骨髓间充质干细胞免疫表型的检测 用胰蛋白酶消化收获第3代细胞，PBS洗涤后，分别与CD71、CD34、HLA-DR（FITC-）与CD13、CD44、CD117、CD45、CD29（PE-）单抗低温避光孵育30 min后，洗涤稀释，流式细胞仪检测。
1.3.3 共孵育体系的制备 取健康人外周血20 ml，用比重为1.077的Ficoll-hypaque进行分离获得单个核细胞（PBMC），RPMI 1640洗涤2次，流式细胞仪检测T细胞纯度。用含10%FBS、100 u/ml链霉素和100 u/ml青霉素的RPMI 1640培养。取24孔板，调整经25μg/ml丝裂霉素37 ℃预处理30 min的MSCs和PHA 5 μg/ml刺激的T细胞浓度，MSCs：T细胞分别按1∶20、1∶40、1∶80的比例混合培养，同时设立单独培养T细胞组、T细胞+PHA组、单独MSCs+PHA组，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养1～7天。
1.3.4 MTT法评估T细胞受抑情况 分为4组：阴性对照组：单独培养T细胞组；阳性对照组：T细胞+PHA组；共孵育组：T细胞+PHA+MSCs组；背景消除组：单独培养MSCs组。将其加入96孔板中，调整反应体系至200 μl/孔，每组设3个复孔，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养3～5天。每孔加入20 μl MTT（5 g/L），继续孵育4 h后，弃上清，加入酸化异丙醇终止，应用酶标仪测定OD值。抑制率=［1-（实验组OD值-阴性对照组OD值）/（阳性对照组OD值-阴性对照组OD值）］×100%，其中，实验组OD值=共孵育组OD值-背景消除组OD值。
1.3.5 T细胞表面活化标记的检测 分别于共孵育第0天、第1天、第3天、第5天和第7天采用流式细胞仪检测各组T细胞的活化标记CD 38、CD 25、CD 69、HLA-DR。
1.4 统计学方法 采用t检验和一元方差分析，应用SPSS 11.5统计软件分析处理实验数据，以P＜0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 形态学观察 原代细胞接种24 h后，可见分散存在的少量贴壁细胞。48～72 h后，可见部分贴壁细胞增殖，表现为在原代单个细胞周围出现2～3个新的细胞。早期贴壁的细胞形态以上皮样细胞为主，胞体较小，细胞核较大。1周左右可见较大克隆出现。传代的细胞形态以成纤维样细胞为主，且克隆形成率明显降低，细胞生长呈现密度依赖性，细胞体积增大，倍增时间由早期24 h逐渐延长至72 h。形态上，AA患者与对照组的骨髓MSCs没有明显的差别。
2.2 免疫表型检测 流式细胞仪检测骨髓MSCs的免疫标记如下：CD13、CD44、CD71、CD29表达阳性；而CD117、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性表达。SAA或CAA患者与对照组以及SAA与CAA患者的骨髓MSCs在免疫标记表达上没有明显区别，见表1。表1 MACs免疫表型检测注：各组间P值均大于0.10
2.3 对T细胞增殖能力及活化的影响 共孵育体系培养至第3天时，MTT法结果显示阳性较阴性对照组的OD值明显上升，表明刺激引起T细胞增殖活跃。而加入骨髓MSCs的实验组OD值较阳性对照组明显下降，并且MSCs的抑制作用随着加入的浓度升高而增强。对照组、SAA组、CAA组的骨髓MSCs对活化T细胞的增殖能力和活化的抑制作用有着明显的差异（图1、图2）。第3天时分别检测了加入对照或AA患者骨髓MSCs的共培养体系中的T细胞活化标志：CD38、CD25、CD69、HLA-DR表达均较单独活化T细胞组有所下降（分别为38%vs 8%，58%vs 14%，76%vs 57%，55%vs 30%）。但AA患者MSCs对活化T细胞的抑制作用比对照组明显减弱（P值分别为0.002、0.007、0.04、0.03）。其中CD38的表达率在各组中有着明显的差异，见表2。而对CD27和CD45RO的影响两者没有明显差异。
3 讨论
AA的病理机制呈现高度的异质性，单一的“种子（HSC缺陷）”、“土壤（造血微环境支持能力异常）”或“虫子（免疫异常）”学说已无法解释AA发病机制。近年研究显示，正常人骨髓MSCs对T细胞具有负性调节作用［3］，在骨髓中有可能因此而形成一个对造血干细胞具有保护作用的微环境［7］。AA与T淋巴细胞及其分泌的某些造血负调控因子所致的HSC增殖及分化损伤有密切关系，上述损害效应由其骨髓中活化的T淋巴细胞（包括HLA-DR＋CD8＋ 细胞，CD8-CD56＋ 细胞及δTCS1＋γ δ- TCR＋细胞等）分泌的多种造血负调控因子，如IFN-γ，肿瘤坏死因子（TNF）-α，TNF-β及巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-α等介导。我们的实验结果显示AA患者骨髓MSCs在形态和免疫表型上并没有明显的改变，体外对活化T细胞的抑制作用呈数量依赖性，与正常骨髓MSCs相似，但AA骨髓MSCs对活化T细胞的抑制作用明显减弱。而且SAA与CAA骨髓MSCs对T细胞的抑制作用也存在明显差异。SAA患者骨髓MSCs对活化T细胞的抑制作用减弱更加明显，这或许可以解释SAA的造血破坏更加严重且亦难恢复的原因。因此推测，AA骨髓造血微环境中存在对造血干细胞的损害因素，在骨髓局部出现免疫失调节。骨髓MSCs作为骨髓造血微环境的重要组成部分，其免疫调节在AA中出现“失责”现象。因此，在受外来抗原等因素作用下，造血微环境出现免疫破坏因素的亢进，免疫抑制因素减弱，以致造血向负调控方向进行，导致疾病的发生。
一些研究发现，足月胎儿的脐血缺乏MSCs［8，9］；临床中发现脐血作为造血干细胞来源进行的移植中，在AA患者中的植入率最低［10］，这似乎也提示AA患者的MSCs存在功能缺陷。越来越多的证据显示AA患者骨髓基质成分与免疫紊乱有着密切联系，两者协同作用抑制HSC的生存、增殖和分化。MSCs的功能之一是通过分泌细胞因子来调节造血干细胞的分化，因此，进一步的研究可通过比较MSCs的分泌功能分化潜能以及与造血干细胞共移植来判断MSCs的质量。临床研究证实抗淋巴细胞球蛋白/抗胸腺细胞球蛋白联合环孢素A的强化免疫抑制治疗可产生70%～80％的有效率，仍有一部分病例属免疫抑制治疗难治或免疫抑制治疗后复发，免疫异常介导的HSC损伤并非AA的唯一致病因素，对AA造血微环境的研究有助于更深入阐明其病理机制，以及开辟AA治疗的新途径。
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（编辑：岳 麓）
作者单位：213003 江苏常州，常州市第一人民医院（△通讯作者）