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【摘要】 目的 通过对59例面部皱纹、颈纹、唇纹、手背纹、鼻唇沟及瘢痕凹陷使用皮肤组织工程学技术—“祛除皮肤凹陷性缺损的注射液”进行治疗后的观察，总结治疗经验。方法 取手术切除的正常皮肤去表皮留含成纤维细胞的组织块，通过细胞培养4~6代后，取5000~8000万个成纤维细胞加入2~6ml生理盐水制成注射液，将注射液注入面部皱纹、颈纹、唇纹、手背纹、鼻唇沟及面部瘢痕凹陷区。结果 注射后皱纹舒平，面部凹陷纠正，美容效果显著。结论 皮肤组织工程学技术—祛除皮肤凹陷性缺损的注射液祛除面部皱纹、颈纹、唇纹、手背纹、鼻唇沟及瘢痕凹陷效果显著，无副作用，能维持较长时间，有推广价值。
【关键词】 组织工程学；面部凹陷；面部皱纹；注射
The application of skin tissue engineering in facial defect
HUANG Jing-xi,QIN Jun-xia.
Center for Biocytological Research, Zhengzhou Military Subdivision, Zhengzhou 450052,China
【Abstract】 Objective To review clinical data of the injecting solution which contain a lot of fibroblasts to treat facial depression in 59 cases,to analyze practical improvement effective of depression in face,and to summarize treatment experiences. Methods Samples of normal skin were collected. The means of cell culture were used to make the injecting solution which contain a lot of fibroblasts. The solution was injected into facial depression and wrinkle area.Each time dose is 2~6ml. The dose used varied according to individual patient. Injecting into dermal layer is appropriate.Results An excellent improvement of facial wrinkle was obtain
ed.The facial depression was corrected in thirty days after injecting.Edema in skin occasionally appeared this symptom disappeared in 2~48h later.Conclusion Skin tissue engineering ——the injecting solution which contains a lot of fibroblasts, to treat facial depression,is a safe technique, which can confirm the reliability in reducing facial wrinkles and filling concave scar. The results are satisfactory.
【Key words】 tissue engineering；facial depression；facial wrinkle； injection
随着年龄的增大，人体皮肤逐渐变得没有光泽并失去弹性，最后形成皱纹。也可以由于意外伤害而造成皮肤凹陷性瘢痕。以前治疗面部凹陷性瘢痕多采用注射牛的胶原蛋白，但维持时间不长，甚至造成皮肤表面出现变态反应，副作用比较大。为了解决变态反应对人体造成的伤害，有些医院采用自制皮制成胶原蛋白注射，但制备过程中需要大量皮肤，注射后仍会被肌肉组织很快吸收。近年来许多人采用注射肉毒素来治疗面部皱纹，但仍维持时间短，治疗效果不理想。
本文采用现代组织工程学技术针对上述现有技术所存在的不足而提供一种除皱和填充皮肤凹陷性缺损的注射液(国家发明专利申请号：2004100660291.X)，经临床应用后效果满意，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织来源 全部取自我科患者的正常皮肤，男9例，女50例，年龄23~58岁，取皮部位为耳后、上臂内侧、大腿内侧、上眼皮或下眼袋。
1.1.2 主要试剂 (1)DMEM培养基（GIBCO BRL 美国）；(2)胎牛血清（GIBCO BRL 美国）；(3)0.25％胰蛋白酶。
1.2 方法
1.2.1 成纤维细胞的培养 用碘伏对受术者耳后、上臂内侧或大腿根部消毒，也可以对拟切除的下眼袋或瘢痕部位进行消毒，然后铺无菌巾。用2％利多卡因局部浸润麻醉；用手术刀将2mm×2mm全层皮肤取下，放入组织保存液中；将取下的皮肤组织块置于培养皿中，加入2ml浓度为0.25％的胰酶/EDTA液，置入CO2孵箱中，37℃下保存30min，使皮肤组织消化；在少量胎牛血清中将标本切成1mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6~8h,使组织块牢固地黏附在瓶壁上；然后加入含15％胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3~4天换液1次；2~3周后，原代细胞生长成单层，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例传代培养，然后每2~3天换液1次，每4~5天分种传代1次。将体外传代至第4~6代的成纤维细胞取5000~8000万个加入2~6ml浓度为0.9％的氯化钠溶液中，配制成注射液。
1.2.2 对面部皱纹及凹陷的注射方法 取配制成的含成纤维细胞的注射液适量，注入面部皱纹或瘢痕凹陷区域，注射的量根据皱纹的多少及瘢痕凹陷区域的面积决定，一般为2~6ml。注射需沿皮肤凹陷部位进针，边推溶液边均匀退针，要求注射在真皮乳头层内，注射到皮肤发白隆起为宜。
1.2.3 疗效评判标准 评判标准分为优、良、差三级。患者注射30天后由操作者与患者共同判定。优：完全达到填平效果，看不到凹陷，患者满意。良：部分达到填平效果，尚能看出凹陷，患者比较满意。差：未达到填平效果，仍可见明显凹陷。
2 结果
59例患者中，53例皱纹（额头纹、鱼尾纹、手背纹、唇纹、鼻唇沟等）患者，优53例；面部瘢痕6例，优4例，良2例 。总优良率100％。祛除皮肤凹陷性缺损的注射液注射后局部稍有肿胀，一般2~48h自然消退。59例患者中无感染，无皮下出血发生。随访2~5年，患者治疗后美容效果显著，表情自然，而且保持时间长久。
3 讨论
3.1 皮肤组织工程学技术—祛除皮肤凹陷性缺损的注射液祛除皱纹填平凹陷的原理 随着年龄增长，皮肤出现衰老。真皮结构的改变是皮肤衰老的主要原因［1］。衰老真皮厚度变薄，密度降低［2］。真皮中含有胶原纤维和弹力纤维，胶原纤维维持着皮肤的韧性，弹力纤维则保持着皮肤的柔软。体内新陈代谢中，胶原纤维和弹力纤维不断衰老，被胶原酶和蛋白水解酶等酶类清理破坏掉，同时成纤维细胞又产生新的纤维来代替它们。随着时间的推移，这种新陈代谢平衡会被打乱，随着年龄的增长，成纤维细胞对抗酶的破坏力的能力降低，胶原纤维和弹力纤维的数量和质量也随之下降，表皮和真皮的交界原有的胶原纤维和弹力纤维的交联结构开始衰退松散，表皮和真皮越来越倾向于分离，有时甚至完全分离。失去了交联结构支撑的表皮就会在重力作用下下垂，于是额部、颞、眶区整体下滑出现皱纹。胶原是愈合过程中细胞生长的依附物和支持物，能诱导细胞增殖、分化和移行。祛除皮肤凹陷性缺损的注射液注入面部皱纹及瘢痕凹陷区后，已经老化、受损导致皱纹出现的胶原蛋白脱水收缩，胶原降解酶降解，清除衰老的胶原，新注入的成纤维细胞即开始产生胶原纤维蛋白，修复表皮和真皮交界面的衰退松散的交联结构，重新排列出自然状态的胶原纤维，最终使衰老受损的皮肤得以重新修复，达到消除皱纹的目的。
3.2 祛除皮肤凹陷性缺损的注射液的应用前景 本法是目前注射类祛皱和填充皮肤凹陷缺损方法［3~5］
中最有发展前景的方法。与以往的方法比较，注射肉毒素［3］治疗面部皱纹维持时间短，欲保持较长时间需要重复注射。胶原蛋白注射也存在维持时间短的缺点［4］，而注射自身脂肪涉及到脂肪细胞存活及液化的问题［5］。比较而言组织工程技术较好地解决了上述方法的不足之处。组织工程学是近10年来发展起来的一门新兴学科，旨在研制开发能够修复和改善损伤或缺失组织之功能形态的人造组织或器官。1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出组织工程这个名词，1988年被定义为“它应用生命科学与工程科学的原理与方法，在可控、可重复条件下，通过哺乳动物、人类（负损患者自身）特定细胞在网络构架的体外培养及体内移植，形成具有特定功能的组织和生物替代物。”组织工程对于医学的发展与保持人类健康有着重大的意义［6］。许多国家正在投入资金实现其商品化，美国已形成价值几十亿美元的产业，培育的骨骼、软骨、血管、皮肤以及各种组织正在进行体内试验。可靠的细胞来源是组织工程研究的首要前提，本文去除皮肤凹陷性缺损的注射液仅需切除2mm3的皮肤组织块，故细胞来源在临床应用上不成问题。接下来，细胞的培养与扩增技术成熟、可靠，制备注射液也没有问题，需要注意的是在某些特定的环境中应用的组织只有在特定的环境条件下培养才能符合临床应用的要求。即研究组织工程中细胞培养与扩增条件时，应当重视在与生理环境类似的条件下的培养，这样才有实用价值。
3.3 祛除皮肤凹陷性缺损的注射液制备和使用方法 本文公开了这种祛除皮肤凹陷性缺损的注射液及其制备方法和使用技术，由5000~8000万个皮肤成纤维细胞和2~6ml浓度0.9％的氯化钠溶液组成。该注射液的制备方法，是将来源于患者自体皮肤成纤维细胞经体外培养和扩增，再按照每5000~8000万个成纤维细胞加入2~6ml浓度0.9％的氯化钠溶液，制成注射液。
3.4 本法优点 本发明的优点在于采用患者自身的皮肤细胞在体外经过培养、扩增后再次注射到需要进行修复的部位。该注射液在这些部位产生胶原纤维蛋白从而使皱纹和瘢痕修复，恢复皮肤弹性并嫩滑美观。由于本发明使用的皮肤组织取自患者自体，无排斥反应和毒副作用，被治疗者用过后美容效果显著，表情自然，而且保持时间长久。更重要的是，本技术创造了“青春银行”的概念，即被治疗者的成纤维细胞样本将能像重要
档案一样，长期储存起来，等若干年后皮肤出现老化症状时，取出被治者年轻时所储存的成纤维细胞重新培育扩增，这样所使用的成纤维细胞功能相对会更强，注射到所需的部位后，祛皱嫩化皮肤的效果就更好，因而储存越早效果越好（幼儿时期即可开始）。
综上所述，皮肤组织工程学技术—祛除皮肤凹陷性缺损的注射液是一种很有发展前景的组织工程技术。
【参考文献】
1 Rohrer TE.Soft tissue filler substances.Curr Prob Dermatol,2001,13:54-60.
2 李卫，元发芝.皮肤衰老及抗衰老研究进展.中华医学美学美容杂志，2004，1：60-61.
3 Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering.Science,1993,260:920-926.
4 秦军侠，黄靖西.肉毒毒素祛除面部皱纹3000例.中国实用医学月刊，2004，8：696-697.
5 秦军侠，张水英，张海水，等.高效美容胶原在面部凹陷性缺损中的应用.中国医药指南，2005，6：15-16.
6 秦军侠，崔正军，张海水，等.自体脂肪颗粒注射移植的临床应用.中华临床与卫生，2005，2：3-4.
作者单位： 1 450052 河南郑州，郑州军分区医院生物细胞研究中心
2 450007 河南郑州，解放军第153医院
(编辑：新 竹)