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【摘要】 目的 通过蛇毒抗高凝状态酶(AHCSE)、氟尿嘧啶（5-FU）对人肝癌细胞BEL-7404（简称7404细胞）、正常LO2肝细胞（简称LO2细胞）作用的比较,研究AHCSE对肝癌的作用以及探讨其可能的作用机制。方法 应用光学显微镜、透射电镜、MTT法、TUNEL、FCM等方法观察7404细胞、LO2细胞经过AHCSE、5-FU处理后，细胞形态学、生物化学等方面的变化。结果 7404细胞、LO2细胞经过AHCSE、5-FU处理后，发生了形态学改变；小剂量AHCSE对7404细胞具有很强的抑制作用，但对LO2细胞几乎无影响；随着剂量的加大，AHCSE对7404细胞抑制率上升不明显，但是出现对LO2细胞的抑制作用。经AHCSE作用后，7404细胞发生了凋亡，凋亡率随AHCSE浓度的增加而增加；与5-FU对7404细胞作用相似，但5-FU对LO2细胞抑制作用明显增强。结论 AHCSE、5-FU对BEL-7404细胞均有很强的抑制作用，诱导细胞凋亡是其作用机制之一，AHCSE可能成为一种新的肝癌细胞凋亡的诱导剂。
【关键词】 蛇毒抗高凝状态酶；细胞凋亡；肝细胞癌；肝细胞
Research on function of the AHCSE to human hepatocellular carcinoma BEL-7404 and normal hepatocellular LO2 cells
CHAI Zhi-ming,ZHANG Zheng-ming,RUI Jing.
Department of Surgery,Wannan Medical College,Wuhu 241001,China
【Abstract】 Objective To investigate the efficacy of antihypercoagulability state enzyme (AHCSE) and 5-FU on human hepatocellular carcinoma BEL-7404 cells, normal hepatocellular LO2 cells and probe into its function.Methods MTT.Phase-contrast-microscope, electron-microscopy, terminal deoxynucleotidy transferase dUTP nick and labeling (TUNEL), flow cytometer (FCM) were conducted to observe the alteration of cell form, biochemistry variety of the AHCSEed cells (or the 5-Fued cells) of BEL-7404 cells, LO2 cells.Results The AHCSEed cells of BEL-7404, altered in their cells forms.The low dosage AHCSE had a very strong inhibition to BEL-7404 cells, nearly no efficacy on LO2 cells.With the dosage increase the rate of inhibition to BEL-7404 cells did not rise markedly, but an inhibition to LO2 cells appeared. After the action of AHCSE apoptosis took place in BEL-7404 cells, the apoptosis index increased with the increase of the dosage. It is very like 5-FUs, but 5-FUs function is very stronger than AHCSE’s.Conclusion The AHCSE /5-FU have very strong inhibition to the BEL-7404 cells. Inducing apoptosis is one of its functions. The AHCSE may possibly become a new kind of drugs that induce apoptosis.
【Key words】 antihypercoagulability state enzyme;apoptosis;hepatocellular carcinoma;hepatocellular
蛇毒作为一种天然的药用资源，含有许多活性成分。大量资料显示，蛇毒很多组分对肿瘤有很好的抑制作用。我们从皖南山区蝮蛇粗毒中提取一种抗高凝状态酶（antihypercoagulability state enzyme，AHCSE）,发现其对实验性肝癌有很强的抑制作用［1,2］，本实验进一步以BEL-7404细胞（7404细胞）、正常肝LO2细胞（LO2细胞）为对象，利用细胞体外培养技术，比较AHCSE、5-FU的抗肿瘤作用及可能作用机制。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1材料 药物：AHCSE用柱层析法从皖南山区的蝮蛇粗毒中提取，由皖南医学院蛇毒研究所文尚武教授提供。细胞株：人肝癌细胞BEL-7404，正常肝细胞LO2源于上海细胞生物学研究所。试剂：RPMI1640培养液（GIBCO公司），小牛血清（FCS）（杭州四季清公司），HEPES（sigma公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），噻唑蓝（MTT）（sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）(sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 测定不同浓度AHCSE、5-FU分别作用于7404细胞、LO2细胞后不同时间内的光密度值（OD）、抑制率（IR） 基本按文献［3,4］方法进行。AHCSE、5-FU经RPMI-1640培养液稀释，分别配成1mg/ml的母液。将于培养瓶中培养了48h的传代7404细胞株用0.25%胰蛋白酶、0.2% EDTA消化后,加入含10%FCS的RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素各100u/ml)，将细胞配制成5×104/ml的细胞悬液，加入96孔培养板中,每孔100μl,置于37℃,5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁生长后(约15h),每孔分别加入不同浓度的AHCSE或5-FU 100μl，AHCSE终浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100μg/ml,5-FU终浓度分别为0.1、0.5、1、10、50、100、500μg/ml,对照组加入RPMI 1640培养液100μl；每组设3复孔。采用MTT法测定经AHCSE或5-FU作用24h、48h后各浓度组的OD、IR值：培养结束前4h加5mg/ml MTT溶液20μl，终止培养时小心吸出孔内培养液，每孔加DMSO 150μl，振荡10min，用酶联免疫检测仪（BIO-RAD）测定其在550nm处的OD值。并计算IR值：IR=(1-用药组OD/对照组OD)×100%。用同样方法测不同浓度AHCSE或5-FU作用LO2细胞的光吸收值、抑制率。
1.2.2 光学显微镜观察 在相差显微镜下观察经不同浓度AHCSE、5-FU处理前、后细胞形态变化。
1.2.3 透射电镜观察 细胞经不同浓度AHCSE、5-FU处理48h，通过消化、打匀、离心等一系列处理后，用4℃ 2%戊二醛固定，各组收集约1×107细胞样品的细胞团块，小心移入青霉素小瓶中，送南京军区总医院电镜室检测观察。
1.2.4 细胞凋亡检测 采用原位末端标记法(TUNEL)定量检测凋亡细胞:将处理过的盖玻片放入6孔板中，接种同浓度、同体积的7404细胞后，再分别加入不同浓度的AHCSE或5-FU，于药物作用24h、48h，收集细胞,PBS洗2次,细胞爬片用多聚甲醛固定后，送南京建成生物工程研究所作TUNEL检测。在光学显微镜下计算凋亡率(AI)。计算方法:随机选取10个高倍视野,分别计算阳性细胞数和细胞总数:AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.2.5 流式细胞术 对经不同浓度AHCSE处理过的7404细胞，培养48h后，消化、分离细胞并移至15ml的锥形管中，检查有单个细胞悬浮，1000rpm离心5min后，弃上清。再用不含Ca2+、Mg2+的PBS（磷酸缓冲液）将细胞洗2次，计细胞数后用约500μl的PBS重悬细胞，加5ml 70%冷乙醇，4℃固定过夜。送上海细胞所行流式细胞术检测细胞凋亡情况。
1.3 统计学方法 统计描述计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，用SPSS11.5软件包进行方差齐性检验,one_way ANOVA和多个处理组与一个对照组比较的Dunnett法，均为双侧检验,α取0.05。
2 结果
2.1 细胞形态 相差显微镜观察经AHCSE、5-FU作用后的7404细胞：培养瓶中细胞经低浓度AHCSE、5-FU处理后，镜下可见悬浮细胞较多,细胞分裂相减少；AHCSE、5-FU浓度较大时,培养液内细胞碎片明显增多；而LO2细胞仅在高浓度AHCSE、5-FU作用下出现悬浮细胞并有细胞碎片。透射电镜下7404细胞组基本形态与对照组相同，但见胞浆内部分线粒体空泡化，成簇，胞膜下多见。另见胞浆中髓鞘样结构形成。但未找到典型的凋亡细胞和凋亡小体。
2.2 AHCSE、5-FU对7404细胞、LO2细胞的光吸收值及抑制率的影响 AHCSE对7404细胞具有明显的抑制作用,AHCSE浓度在0.5μg/ml以上组与同时间对照组OD值比较差异有显著性，见表1。由于AHCSE作用于培养细胞，不同的药物浓度作用时，因培养细胞总体增殖与总体死亡不同,会出现OD值的不同。小剂量时各组细胞因总体增殖大于总体死亡,所以在相同药物浓度作用下48h的OD值较24h大；大剂量时各组细胞因总体死亡大于总体增殖,所以在相同药物浓度下作用48h的OD值较24h小。但是AHCSE对BEL-7404细胞的抑制率随AHCSE浓度的增大和作用时间延长的而增大。同样方法可了解5-FU对7404细胞的光吸收值及抑制率，见表2。AHCSE、5-FU对LO2细胞的作用，见表3、4。AHCSE、5-FU对BEL-7404细胞具有明显的抑制作用,AHCSE为0.5μg/ml，5-FU为1μg/ml时与同时间对照组OD值比较有统计学意义，AHCSE浓度在不小于0.5μg/ml，5-FU不小于1μg/ml时各组与同时间对照组OD值比较差异有非常显著性（P＜0.01）,当AHCSE浓度≥75μg/ml时抑制作用存在明显的剂量时间依赖关系（P＜0.01）。AHCSE对LO2细胞影响很小（P＝1.000），浓度为75μg/mL时才有统计学意义（P=0.049），而5-FU在浓度1μg/ml时,作用48h时对LO2细胞存在抑制作用（P＜0.05）。
表1 不同浓度AHCSE作用BEL-7404细胞后不同时间的光吸收值、抑制率 （略）
注：与同一时间对照组比较，**P＜0.01
表2 不同浓度5-FU作用BEL-7404细胞后不同时间的光吸收值、抑制率 （略）
注：与同一时间对照组比较，*P＜0.05；与同一时间对照组比较，**P＜0.01
2.3 细胞凋亡检测 采用TUNEL法定量检测凋亡细胞,AHCSE、5-FU各剂量组的凋亡情况见表5。
当AHCSE、5-FU剂量为10μg/ml时与对照组比较差异均有统计学意义（P=0.000），剂量为100μg/ml时细胞凋亡率更高；AHCSE、5-FU两剂量组48h细胞凋亡率均较24h明显（P＝0.000）。通过FCM检测，得到AHCSE作用7404细胞48h细胞凋亡率（％,χ±s）：对照组为4.15±0.42，AHCSE浓度为5μg/ml时为10.25±0.57，AHCSE浓度为10μg/ml时为16.22±2.77，AHCSE浓度为100μg/ml时为23.21±3.01。浓度为10μg/ml和100μg/ml时与对照组比较P=0.000，浓度为100μg/ml时凋亡率更高。这与TUNEL法检测结果相一致。
表3 不同浓度AHCSE作用LO2细胞后不同时间的光吸收值、抑制率 （略）
注：与同一时间对照组比较，**P＜0.01
表4 不同浓度5-FU作用LO2细胞后不同时间的光吸收值、抑制率（略）
注：与同一时间对照组比较，*P<0.05；与同一时间对照组比较，**P<0.01
表5 不同浓度AHCSE、5-FU作用7404细胞后不同时间的细胞凋亡率 （略）
注：与同一时间对照组比较，**P<0.01
3 讨论
蛇毒作为一种天然药用资源，很多组分已被证实对不同肿瘤有一定程度的杀伤作用，但作用成分和作用机制不尽相同［5～7］。我们对AHCSE的体内试验证实其对肿瘤有一定的杀伤作用，作用效果与5-FU相似［1，2］，本实验通过比较AHCSE和5-FU的作用，进一步了解AHCSE的作用效果及其可能作用机制。
本实验选择了BEL-7404细胞、LO2细胞作为实验对象，利用细胞体外培养技术，进行了进一步研究。结果表明：低浓度AHCSE对7404细胞有明显的抑制作用，而对LO2细胞几乎无作用；随AHCSE剂量加大，其对7404细胞的抑制作用虽有所增大，但增加却不甚明显，而逐渐对LO2细胞出现显著的抑制作用。AHCSE对7404细胞的作用与5-FU效果相近，但5-FU在较低剂量就对LO2细胞有较强的抑制作用。AHCSE、5-FU对7404细胞、LO2细胞抑制率与作用时间不相一致可能与药物的半衰期、细胞的生长周期、细胞生长速度有关。大剂量5-FU并不能杀死所有癌细胞，这与5-FU特异性作用于S期细胞有关。这也是临床上控制5-FU剂量、作用时间、为减少毒副作用的原因。中小剂量的AHCSE对7404细胞作用敏感，但对LO2肝细胞影响不大，表明AHCSE的作用安全有效，其浓度约为0.5～50μg/ml,也提示其对正常肝细胞和肝癌可能呈不同生物学行为。有资料显示，蛇毒可能作用于癌细胞表面的特异性受体，这也是蛇毒组分对癌细胞有选择性、副作用小的原因之一［8～9］。
从光镜、电镜结果示悬浮细胞和细胞碎片增多，胞浆内部分线粒体空泡化，成簇，胞膜下多见，胞浆中髓鞘样结构形成等进一步证实AHCSE对肝癌细胞有直接杀伤作用。从TUNEL、FCM检测结果可知：AHCSE能够诱导体外培养的7404细胞凋亡，电镜下未找到典型的凋亡细胞和凋亡小体，可能与送检的细胞数量极大，凋亡细胞相对较少等有关,有文献报道培养细胞在电镜下不易观察到典型的凋亡小体。
肿瘤细胞是一种应凋亡而未正常凋亡的细胞。细胞凋亡是由细胞内基因编程所控制。外界刺激经过复杂的信号传导系统进入细胞核，作用于细胞凋亡相关基因，如P53、Fas、Bcl-2等基因启动了细胞凋亡相关程序，诱导细胞凋亡。诱导细胞凋亡研究手段已经作为筛选抗肿瘤药物的一种有效方法。我研究小组对AHCSE的体内外抗肿瘤实验研究已初步证实了其可诱导肝癌细胞凋亡，对肝癌细胞有明显的抑制作用。因而为AHCSE最终应用于临床提供一定的理论依据。
肝癌是一种严重危及人类健康的恶性程度较高的肿瘤，且对放化疗不甚敏感，有必要寻找另类新的作用靶点的治疗方法。本实验结果初步显示，AHCSE可能成为一种新的肝癌细胞凋亡的诱导剂。
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(编辑：李建伟)
*基金项目：安徽省教育厅自然科学基金资助项目（编号：2004kj347）
作者单位： 241001 安徽芜湖，皖南医学院手术学教研室
241001 安徽芜湖，皖南医学院弋矶山医院普外科