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Wuhan Institute of Biological Products，Wuhan430060，China
【Abstract】 Objective Inclusion bodies of human soluble TRAIL which expressed in Escherichia coli DH5αwere solubilized and refolded as well as rapid purified in order to prepare antitumor TRAIL moleculars.Methods A re-combinant temperature inducible prokaryotic expression vector coding for human soluble TRAIL was expressed under temperature inducing.Inclusion bodies of human soluble TRAIL were solubilized with6M GuHCL and refolded through diluting and dialysis in a buffer system，and then the unrefolding components were removed by centrifugation.Results sTRAIL was expressed with high efficiency in the form of inclusion body under temperature inducing.The refolding efficiency of the solubilized inclusion bodies were more than40percentage and could be rapid purified by a simple centrifugation step with which the purity reach to98%as judged by SDS-PAGE electrophoresis.The refolded sTRAIL molecular but not the unrefolded inclusion body proteins could be recognized by a specific monoclonal anti-body which confirmed by sandwich ELISA.FACS analysis showed that the renatured sTRAIL exhibited strong apop-totic activity against human leukemic cell line K562.Conclusion An effective procedure for renaturation of sTRAIL inclusion bodies was developed in which the sTRAIL can be rapid purified with high purity by a simple method.
【Key words】 sTRAIL;inclusion bodies;renaturation;purification;apoptosis
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）或称凋亡素2配体（Apo2L），属于肿瘤坏死因子家族成员，1995年Wiley等 ［1］ 人从外周血液淋巴细胞和人心脏组织来源的cDNA文库中利用与TNF同源的表达序列标签分析出了TRAIL的cDNA全长（1769bp）序列，并初步检测了它的生物活性。进一步研究表明，TRAIL对大多数来源于人类肿瘤的癌细胞系均有一定的杀灭作用，包括来自于直肠、肺、乳腺、肾、前列腺、胰腺、皮肤、脑及血液系统的肿瘤细胞，但是对正常细胞几乎无毒性作用 ［2～4］ ，并且TRAIL的抗瘤活性与常规的放疗和化疗有协同增强作用 ［5］ ，因而是一种很有前途的抗肿瘤新药。
在大肠杆菌中能够表达出具有抗肿瘤活性sTRAIL，但在高效率的原核表达系统中，由于缺乏转录后加工及辅助肽链折叠的酶系，表达产物极易形成无活性的包含体，需要有效的复性方法。复性过程一方面可稀释或清除溶解包含体的变性剂等成分，另一方面提供利于多肽链折叠的化学环境，常用的方法包括稀释法、透析法、凝胶过滤法等 ［6］ 。本研究采用稀释法并结合透析以清除变性剂及相关的添加成分，达到较高的复性率，并且可通过离心快速提纯。
1 材料与方法
1.1 材料 重组质粒pBVT8包含人sTRAIL（第114～281位氨基酸）编码序列，由本所构建;抗人TRAIL单克隆抗体MAB687、多克隆抗体AF375及HRP标记的驴抗羊抗体HAF109购自R&D公司;盐酸胍（GuHCl）、精氨酸、二硫苏糖醇（DTT）、Triton X-100及HRP标记羊抗鼠Ig购自Sigma公司;硝酸纤维素（NC）膜为Amersham Biosciences产品;人白血病细胞株K562由本室保存，FITC标记的重组人Annexin V凋亡检测试剂盒购自Bender公司。
1.2 方法
1.2.1 收集包含体 将重组质粒pBVT8，在LB培养基（含氨苄青霉素100μg/ml）中，于30°C培养至吸光度A 600 约为0.6h，将温度调至42°C诱导表达5h，3000r/min离心30min收集细菌;将收集的细菌用缓冲液（50mM PBS、0.5mM EDTA及1mM DTT）悬浮，经超声裂解后于12000r/min下离心10min，沉淀即为粗制包含体，进一步用含2M尿素和0.5%Triton X-100的PBS缓冲液洗涤3次，置-20°C备用。
1.2.2 包含体蛋白变性、复性及纯化 将包含体溶解于6MGuHCl中，用1M NaOH调节pH值为8.6，于室温静置30min后，12000r/min离心除去不溶物，收集上清，用含0.5MNaCl、2M尿素、0.2M精氨酸、20mM DTT及0.1mM Zn-SO 4 ，pH7.6的50mM PBS作为包含体稀释液将其蛋白浓度稀释到约1mg/ml，再于含0.3MNaCl及1mM DTT pH7.6的磷酸盐缓冲液中进行透析复性36h，每12h更换1次透析液，12000r/min离心除去沉淀。SDS-PAGE进行检测。
1.2.3 Western blotting 将溶解的包含体蛋白及复性纯化后的重组TRAIL蛋白各10μl经SDS-PAGE电泳分离后，用半干法电转移到NC膜，室温干燥后用5%脱脂奶粉于4°C封闭过夜;用多克隆抗人TRAIL抗体（羊）孵育1h，TBS-T（pH8.0，10mM Tris-HCl，150mM NaCl及0.05%Tween20）洗膜3次，每次10min;再用1:1000稀释的HRP标记驴抗羊Ig孵育1h，同上洗3次;最后DAB/NiCl 2 显色10min，终止反应。
1.2.4 TRAIL ELISA检测 采用夹心法ELISA，用10mM pH9.6的碳酸盐缓冲液将多克隆抗人TRAIL抗体稀释到2μg/ml，每孔100μl加入到酶标板孔中，于4°C包被过夜，TBS-T洗涤后，用5%脱脂奶粉于37°C封闭1h，再依次加入重组sTRAIL、抗人TRAIL单抗及HRP标记的羊抗鼠Ig于37°C反应1h，每步反应过后均用TBS-T洗涤3次，每次5min，最后进行显色及终止反应，于496nm波长测OD值。
1.2.5 细胞培养及凋亡检测 将人白血病细胞株K562用含10%小牛血清的RPMI-1640（Gibco）于24孔板中进行培养，细胞接近长满时加入不同浓度的重组sTRAIL继续培养24h后，收集细胞，用冷PBS洗涤2次，再用1倍的结合缓冲液（Bender）悬浮细胞，使其浓度为10 5 /100μl，加入10μl An-nexin V-FITC，避光反应15min，用1倍的结合缓冲液洗涤1次，同上悬浮，加入20μl PI，流式细胞仪（Beckman Coulter）进行凋亡检测。
2 结果
2.1 TRAIL包含体溶解、复性及纯化 TRAIL包含体在6M GuHCl溶液中较易溶解，碱性条件能使其溶解更充分。将溶解的包含体蛋白快速稀释到浓度约1mg/ml时，溶液仍呈清亮状态，在随后的透析过程中，发现随着变性剂浓度的降低，会有许多絮状沉淀物出现，通过高速离心后，将沉淀和上清分别进行电泳显示，结果显示上清中可见一条sTRAIL带，而杂蛋白条带则完全消失（图1，lane3和lane4），凝胶积分扫描显示其纯度达98%以上;沉淀中除了未复性的sTRAIL条带外，还有各种杂蛋白条带（图1，lane2），表明复性过程除可使目的蛋白恢复天然构象外，还可通过离心起到快速纯化的作用。
2.2 免疫学鉴定 Western blotting结果显示，无论是复性后的TRAIL分子还是未复性的包含体蛋白都能被多克隆抗人TRAIL抗体识别，在19.6KDa处都有特异性信号带（图2），表明多克隆对TRAIL的天然表位和变性表位均可识别。
夹心法ELISA检测表明:复性后的总蛋白及离心纯化的上清中TRAIL阳性效价均可达10 -8 ，而复性后的离心沉淀与未复性的包含体蛋白均为阴性。表明此单抗仅识别TRAIL的天然表位。因此，用ELISA可对复性条件进行优化。
2.3 抗肿瘤活性 图3为流式细胞仪检测结果，在不同浓度（0、0.1、0.5及1.0μg/ml）的重组sTRAIL诱导下，Annexin V-FITC荧光染色比例递增，表明sTRAIL对人白血病细胞株k562的凋亡率有明显的量效关系。
3 讨论
TRAIL分子细胞外段不含糖基化位点等结构，原核表达可以胜任，已经有许多研究人员在原核系统成功地制备出具有抗肿瘤活性的sTRAIL ［7，8］ 。本研究采用热诱导型原核表达载体对人sTRAIL基因进行非融合性表达，目的基因以包含体形式获得高效表达。在sTRAIL包含体的复性过程中，我们分别对溶液的pH值、离子强度、还原剂和各种添加成分如精氨酸等的影响进行了观察，以便对复性条件进行优化。在对表达产物进行免疫学检测发现所采用的多克隆抗体能识别TRAIL的变性表位和天然表位，而所用的单克隆抗体仅识别天然表位，因而采用夹心法ELISA对不同条件下目的蛋白的复性效果进行特异性检测，从而对复性条件进行优化，结果目的蛋白在高浓度（1mg/ml）下可获得满意的复性效果。
为方便表达产物的纯化，通常在产物末段添加外源性纯化标签，如亮氨酸拉链、六聚组氨酸等，但是研究表明加入外源性标签的重组sTRAIL可引起正常的肝细胞等的凋亡，从而限制其应用 ［9］ 。我们在对包含体复性的条件进行优化时意外地发现，将复性产物经离心除掉沉淀后，在SDS-PAGE电泳仅出现单一的目的蛋白条带，凝胶扫描纯度大于98%，并且对不同批次的包含体进行复性，重复性亦很好。究其原因可能是采用ELISA法对复性条件进行优化时，能够针对性提高目的蛋白TRAIL的复性率，而包含体中的杂蛋白几乎没有复性，变性的蛋白在溶液中呈现絮状，通过高速离心后可随沉淀而清除。就我们所知，包含体复性后采用离心法即获得高纯度的产物尚属首次报道。
（本文图片见封三）（略）
【参考文献】
1 Wiley S R.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity，1995，3（6）:673-82.
2 Ashkenazi A，VM Dixit.Apoptosis control by death and decoy recep-tors.Curr Opin Cell Biol，1999，11（2）:255-260.
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作者单位:430060湖北武汉，武汉生物制品研究所（* 通讯作者）